[发明专利]一种白叶枯菌小种分离鉴定方法

摘要

本发明公开了一种白叶枯菌小种分离鉴定方法，属于小种鉴定技术领域。提取样品中的微生物的总核酸并构建高通量测序文库；寻找基因组上的变异位点；通过滑动平移筛选高多态性位点，并在在候选位点两侧设计多重扩增引物；利用固体培养基分离样品中的单菌落并做进一步纯化，以获得单克隆菌落；提取菌落的基因组DNA后利用上述步骤设计的引物进行扩增并测序；基于测序结果单克隆菌落进行分型，具有不同基因型的菌落作为不同的小种进行后续研究。本方法不需要预先知道样品中的小种数量以及丰度等信息，也无需传统的筛选过程中所需要生理生化鉴定试验，只需通过高通量测序和扩增即可分离培养出样品中的全部小种，过程简单、快速且流程规范。

主权项

1.一种白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取需要分离和鉴定的水稻叶片的总核酸，然后构建高通量测序文库；(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序，并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上；(3)根据比对结果获取所有的变异位点，然后按照窗口平移获得每个窗口的基因型数目，计算每个窗口的多态性，选择多态性高且处于单拷贝区域作为候选分子标记位点；(4)在每个分子标记位点的两侧寻找保守区域，在保守区域设计扩增引物；(5)将需要分离和鉴定的水稻叶片做10倍稀释后涂平板，恒温培养后挑取单个的菌落并在新的固体培养基平板上纯合后获得单克隆的菌落；(6)提取菌落的核酸后用步骤(4)设计的引物进行扩增，对扩增产物测序后分型；(7)所有分型结果相同的单克隆仅保留一个；若有部分已发现基因型在所有克隆中都不存在，则重新挑取菌落纯化并重复上述过程，直到获得该白叶枯菌小种。