[发明专利]一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统

摘要

本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及一种产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，本发明利用转座子系统，将两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组整合入HepG2细胞，获得整合有不同拷贝数HBV基因组的克隆株HepG2‑HBV/loxP细胞系，其本身不表达HBsAg，当通过腺病毒转导引入Cre酶后，即生成rcccDNA并表达HBsAg，HBsAg的表达与rcccDNA的产生和水平密切相关；rcccDNA的生成快速且稳定，结构特征与真实HBV cccDNA类似，可以支持病毒的转录、复制和蛋白表达；所述rcccDNA可通过设计特异引物利用定量PCR定量检测，以及利用地高辛标记系统行Southern Blot检测。本发明建立的细胞系统可用于建立HBV cccDNA相关生物学研究和抗HBV药物的筛选和评价的平台。

主权项

1.一种产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，通过下述方法建立HepG2‑HBV/loxP细胞系：①质粒构建：pSBbi‑rcccDNA质粒由pSBbi‑GP载体质粒(Addgene#60511)插入两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组构建成；pCMV‑SB100为Cre重组酶表达质粒(Addgene#34879)；②细胞转染：HepG2细胞以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺)培养，将处于生长对数期的细胞，胰酶消化、计数，按1×10⁶细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养过夜，待细胞约80‑90％融合成片时用于转染，按照每孔转染2μg的量，将1.8μg pSBbi‑rcccDNA与0.2μg pCMV‑SB100稀释于100μl纯DMEM培养液中，同时将100μl纯DMEM培养液与12μl PEI转染试剂混合，将稀释后的PEI与质粒混和，室温静置20分钟，将混合物均匀滴加入6孔板中，8小时后更换新鲜培养液，继续培养；③克隆筛选：转染后48小时后，扩大培养至10cm培养皿，待细胞贴壁后加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，每3天换液一次；4周后，嘌呤霉素抗性单克隆形成，挑取单克隆至96孔培养板扩大培养，每4天传一代，以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，1μg/ml嘌呤霉素)培养，批量冻存；④检测HBV基因组整合拷贝数：采用EasyPure Genomic DNA kit(#EE101)抽提基因组DNA，定量PCR试剂采用Thunderbird SYBR qPCR Mix，扩增仪采用StepOnePlus，HBV序列以引物5’‑ATGACCGAGTACAAGCCCACGGT‑3和5’‑TTCGAATCAGGCACCGGGCTT‑3’进行扩增，同时扩增19号染色体基因组上相同长度序列作为内参。