[发明专利]一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统

权利要求书

1.一种产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，通过下述方法建立HepG2-HBV/loxP细胞系：

①质粒构建：pSBbi-rcccDNA质粒由pSBbi-GP载体质粒(Addgene#60511)插入两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组构建成；pCMV-SB100为Cre重组酶表达质粒(Addgene#34879)；

②细胞转染：HepG2细胞以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺)培养，将处于生长对数期的细胞，胰酶消化、计数，按1×10⁶细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养过夜，待细胞约80-90％融合成片时用于转染，按照每孔转染2μg的量，将1.8μg pSBbi-rcccDNA与0.2μg pCMV-SB100稀释于100μl纯DMEM培养液中，同时将100μl纯DMEM培养液与12μl PEI转染试剂混合，将稀释后的PEI与质粒混和，室温静置20分钟，将混合物均匀滴加入6孔板中，8小时后更换新鲜培养液，继续培养；

③克隆筛选：转染后48小时后，扩大培养至10cm培养皿，待细胞贴壁后加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，每3天换液一次；4周后，嘌呤霉素抗性单克隆形成，挑取单克隆至96孔培养板扩大培养，每4天传一代，以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，1μg/ml嘌呤霉素)培养，批量冻存；

④检测HBV基因组整合拷贝数：采用EasyPure Genomic DNA kit(#EE101)抽提基因组DNA，定量PCR试剂采用Thunderbird SYBR qPCR Mix，扩增仪采用StepOnePlus，HBV序列以引物5’-ATGACCGAGTACAAGCCCACGGT-3和5’-TTCGAATCAGGCACCGGGCTT-3’进行扩增，同时扩增19号染色体基因组上相同长度序列作为内参。

2.按权利要求1所述的产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，其生物学特性为：

1)利用转座子系统，将两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组整合入HepG2细胞，获得整合有不同拷贝数HBV基因组的克隆株HepG2-HBV/loxP；

2)HepG2-HBV/loxP本身不表达乙肝表面抗原HBsAg，当通过腺病毒载体引入Cre酶后，即生成重组的HBV rcccDNA，并表达HBsAg；HBsAg的表达与rcccDNA的产生和水平密切相关；

3)HepG2-HBV/loxP细胞系中生成的rcccDNA通过设计特异引物利用定量PCR进行定量检测；并且利用地高辛标记系统通过Southern Blot进行检测；

4)rcccDNA的生成快速且稳定，结构特征与真实HBV cccDNA类似，可支持病毒的转录、复制和蛋白表达。

3.按权利要求1所述的产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，所述的的细胞系，包含37个克隆株，分别整合有不同拷贝数的HBV基因组。

4.按权利要求1所述的产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，所述的细胞系，其建立方法中通过利用转座子系统，将两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组整合入HepG2细胞。

5.按权利要求1所述的产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，所述的细胞系，其产生rcccDNA的方法中利用低剂量MOI＝2的腺病毒载体转导引入Cre重组酶，对loxP位点进行切割重组产生rcccDNA。

6.权利要求1所述的产生HBV(r)cccDNA的细胞系统在建立HBV cccDNA相关生物学特性研究平台中的应用。

7.权利要求1所述的产生HBV(r)cccDNA的细胞系统在建立筛选、评价抗HBV药物平台中的应用。