[发明专利]一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统

说明书

本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及一种产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，本发明利用转座子系统，将两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组整合入HepG2细胞，获得整合有不同拷贝数HBV基因组的克隆株HepG2‑HBV/loxP细胞系，其本身不表达HBsAg，当通过腺病毒转导引入Cre酶后，即生成rcccDNA并表达HBsAg，HBsAg的表达与rcccDNA的产生和水平密切相关；rcccDNA的生成快速且稳定，结构特征与真实HBV cccDNA类似，可以支持病毒的转录、复制和蛋白表达；所述rcccDNA可通过设计特异引物利用定量PCR定量检测，以及利用地高辛标记系统行Southern Blot检测。本发明建立的细胞系统可用于建立HBV cccDNA相关生物学研究和抗HBV药物的筛选和评价的平台。

技术领域

本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及一种产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，具体涉及一种能简单高效产生乙型肝炎病毒(r)cccDNA的细胞系统及其建立方法和用途。

背景技术

现有技术公开了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的重大传染病。据统计，全球有约20亿人感染或曾经感染HBV，其中2.4亿为慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)感染患者。据调查显示，慢乙肝患者罹患肝硬化、肝衰竭和肝癌的风险显著增高。虽然近年来慢乙肝的治疗取得了一定的进展，但治疗疗程、耐药及停药后复发等一系列问题仍是目前困扰临床的难题，业内认为，其中一个重要的原因即是HBV特征性的结构分子“共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA，cccDNA)”的持续存在和难以清除。

研究公开了HBV cccDNA由其前体松弛环状DNA(rcDNA)在宿主DNA聚合酶等的作用下形成，其中rcDNA可来源于新感染的病毒颗粒或病毒复制过程中新合成的病毒核心颗粒。HBV cccDNA在胞核内与病毒Core蛋白、宿主组蛋白及多种调控蛋白形成微小染色体(minichromosome)的结构，可转录生成病毒mRNA，其中前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)是病毒蛋白翻译和逆转录复制的模板，因此，只有清除了细胞核内的cccDNA，才有实现完全治愈慢性乙型肝炎的可能；而现有抗病毒药物的作用机制均不直接靶向cccDNA，对肝细胞内cccDNA的影响较为有限。

受限于体内体外实验模型的局限，目前对cccDNA的形成、活性调控和降解等生物学特性的认识仍存在若干空白。目前用于研究HBV的体外细胞模型中，人原代肝细胞获得困难，价格昂贵；HepG2.2.15、HepAD38和HepDES19等非感染模型中cccDNA形成均很少甚至没有，在这些模型中，质粒替代cccDNA成为病毒复制的主要模板；而在HepaRG、HepG2/Huh7-NTCP等感染系统中形成的cccDNA仍然很少，难以用Southern印迹杂交(Southern Blot)检测到信号，并且这些感染细胞模型的培养操作比较复杂耗时，限制了它们在高通量筛选中的应用。

近期，中国科学院上海巴斯德研究所邓强课题组报道了一种基于Cre/loxp介导的位点特异性重组诱导生成重组cccDNA(rcccDNA)的策略。

基于现有技术的基础，本发明拟提供一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，将用于HBV cccDNA相关生物学特性研究和抗HBV药物，特别是直接靶向于cccDNA的新型药物的筛选评价。

发明内容

本发明的目的在于克服现有HBV cccDNA研究模型的不足，建立一种可以简便高效地产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，将用于HBV cccDNA相关生物学特性研究和抗HBV药物的筛选评价。

本发明结合了转座子和Cre/loxP两个系统，建立了一种新型的HBV(r)cccDNA细胞模型，为HBV cccDNA相关研究和药物筛选特别是直接靶向于cccDNA的新型药物的筛选评价提供了一个高效的平台。