[发明专利]人呼吸道合胞病毒三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

摘要

本发明提供一种人呼吸道合胞病毒三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，涉及通用型、A型和B型，由定量PCR反应液、HRSV标准品、HRSV阴性对照品、HRSV阳性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、RNA反转录酶、耐热DNA聚合酶、三对上、下游引物、HRSV通用型探针、HRSVA型探针和HRSVB型探针。利用本发明试剂盒，对样品中的HRSV不仅能进行分型检测，而且对阳性病毒能进行实时准确定量，灵敏度达1.0×101拷贝/μL，节约生产和检测成本，提高检测效率，满足临床诊断需求，有助于及时制定针对性治疗方案。 1

主权项

1.一种人呼吸道合胞病毒三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液、HRSV标准品、HRSV阴性对照品、HRSV阳性对照品组成；其特征在于，定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、RNA反转录酶、耐热DNA聚合酶、三对上、下游引物、HRSV通用型探针、HRSVA型探针和HRSVB型探针；

通用型HRSV检测引物和探针：

HRSV1：5'‑GCAAATATGGAAACATACGTGAA‑3'

HRSV2：5'‑ACCCATATTGTWAGTGATGCAG‑3'

Probe‑HRSV7：5'‑FAM‑CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGC‑BHQ1‑3'；

HRSV A型检测引物和探针：

HRSV3：5'‑CAACTTCTGTCATCCAGCAA‑3'

HRSV4：5'‑GCACATCATAATTAGGAGTATCAAT‑3'

Probe‑HRSV8：5'‑JOE‑ACACCATCCAACGGAGCACAGGAGATA‑BHQ1‑3'；

HRSV B型检测引物和探针：

HRSV5：5'‑GATGCAAATCATAAATTCACAGGA‑3'

HRSV6：5'‑TCCAGCATCTTTAAGTATCTTTATAGT‑3'

Probe‑HRSV9：5'‑TAMRA‑GGTATGTTATATGCTATGTCCAGGTTAGGAAGGG‑BHQ2‑3'；以及

其中，W为A or T；

HRSV标准品序列为：

atccgccaatcagccaaacagccaacaaaacaaccagccaatccaaaaccagccacctggaaaaaatcgacaatatagttacaaaaaaagaaaagggtggggcaaatatggaaacatacgtgaacaagcttcacgaaggctccacatacacagctgctgttcaatacaatgtcctagaaaaagacgatgaccctgcatcacttacaatatgggtgcccatgttccaatcatctatgccagcagatttacttataaaagaactagctaatgtcaacatactagtgaaacaaatatccacacccaagggaccttca。

2.根据权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于，HRSV阴性对照为无菌注射用水样品，HRSV阳性对照为HRSV灭活病毒株样品。

3.根据权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于，本发明试剂盒保存于‑20℃，减少反复冻融。

4.根据权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒通用型、A型和B型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于，用于荧光定量RT‑PCR扩增反应的PCR反应体系以20μl计为：引物HRSV1、HRSV2、HRSV3、HRSV4、HRSV5、HRSV6终浓度各为0.4μmol/L，Probe‑HRSV7终浓度为0.2μmol/L，Probe‑HRSV8终浓度为0.4μmol/L，Probe‑HRSV9终浓度为0.4μmol/L，2.5mmol/L dNTPs 2μL，MgCl₂ 0.8μL，10×ExTaq酶缓冲液2μL，RNA反转录酶0.4μL,5U/μLExTaqDNA聚合酶0.4μL，RNA模板2μL，去离子水补足至总体积20μL。

5.根据权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒通用型、A型和B型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于，扩增反应条件为：42℃5分钟；95℃2分钟；95℃10秒，55℃40秒，共40个循环。