[发明专利]用于测量和校准多重PCR反应中的扩增偏倚的组合物和方法

摘要

本发明描述了用于使一组高度异质的寡核苷酸引物的DNA扩增效率标准化的组合物和方法，所述寡核苷酸引物通常可用于扩增一组异质的DNA模板，所述DNA模板含有编码T细胞受体(TCR)或免疫球蛋白(IG)的重排淋巴样细胞DNA。本发明所公开的实施例可用于克服在利用扩增引物亚组过程中的非期望的偏倚，所述非期望的偏倚导致对扩增产物进行多重高通量测序以定量样品中的独特TCR或Ig编码基因组时的不精确。本发明提供了供用作扩增引物组的校准用标准品的组合物，所述组合物包含基本上等摩尔量的多种多样性的模板寡核苷酸。本发明还提供了用于在扩增期间识别和修正偏倚引物效率的方法。

主权项

一种用于测定一组寡核苷酸引物的成员中的非均一核酸扩增潜能的方法，所述一组寡核苷酸引物能够扩增生物样品中编码一种或多种适应性免疫受体的重排核酸分子，所述生物样品包含来自哺乳动物受试者的淋巴样细胞的重排核酸分子，所述方法包括：(a)在多重PCR反应中使用所述寡核苷酸引物组扩增包含多种模板寡核苷酸的组合物，以获得多种扩增的模板寡核苷酸，其中各模板寡核苷酸沿5’‑3’方向包含：(i)包含适应性免疫受体可变(V)区编码基因序列或其互补序列的至少20个且不超过1000个连续核苷酸的V寡核苷酸序列，并且每种V寡核苷酸包含独特的V区寡核苷酸序列，和(ii)包含适应性免疫受体连接(J)区编码基因序列或其互补序列的至少15个且不超过600个连续核苷酸的J寡核苷酸序列，并且每种J寡核苷酸序列包含独特的J区寡核苷酸序列；和其中各模板寡核苷酸进一步包含一个或多个随机寡核苷酸序列；且其中所述多种模板寡核苷酸包含至少a种或至少b种独特寡核苷酸序列，以较大者为准，其中a是所述受试者中的独特适应性免疫受体V区编码基因区段的数量并且b是所述受试者中的独特适应性免疫受体J区编码基因区段的数量，并且所述组合物包含至少一种针对每种独特V区寡核苷酸的模板寡核苷酸和至少一种针对每种独特J区核苷酸的模板寡核苷酸；(b)对所述多种扩增的模板寡核苷酸进行测序，以对构成所述多种的每种独特模板寡核苷酸测定(i)模板寡核苷酸序列，和(ii)所述模板寡核苷酸序列的出现频率；以及(c)将每种所述模板寡核苷酸序列的出现频率与预期分布进行比较，其中所述预期分布基于构成所述组合物的所述多种模板寡核苷酸的预定摩尔比，并且其中所述模板寡核苷酸序列的所述出现频率与所述预期分布之间的偏差指示所述寡核苷酸扩增引物组的成员间的非均一核酸扩增潜能。