[发明专利]一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法

摘要

本发明涉及一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，属于基因工程技术领域。本发明通过直接裂解法能快速获得细胞基因组DNA，结合荧光PCR技术以及基于测序仪的毛细管电泳方法，可以在短时间内精确地对多个基因位点敲除的单克隆细胞进行大规模基因型鉴定。本发明不需要使用试剂盒抽提基因组DNA，对细胞的处理时间只需要25min，极大地节省了经济和时间成本，灵敏度和精确度极高，只需要极少量DNA即可，而且对1个碱基的差异都可以准确检测出来；本发明因为不涉及DNA抽提，对样本进行PCR以后经过简单的稀释、变性和毛细管电泳即可以检测分析，没有繁琐的步骤，所以适合大规模批量化操作。

主权项

一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1)针对目标基因设计特异性的打靶位点，构建CRISPR/Cas9载体后转染细胞系，所述CRISPR/Cas9载体上带有能够被流式细胞仪识别检测的荧光标记；2)使用流式细胞仪对转染细胞进行分选，获得阳性单克隆细胞；3)将阳性单克隆细胞扩大培养，取培养后的细胞采用裂解液直接裂解，获得DNA溶液；4)设计上下游引物，使得PCR扩增序列覆盖打靶位点，对上游引物5‘端进行FAM荧光标记，用步骤3)中的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增，获得单克隆细胞PCR产物；5)制作标准分子量内参DNA：所述标准分子量内参DNA使用ROX进行标记，片段大小分别为：79、90、105、131、151、182、201、254、279、306、337、362、402和425；6)将甲酰胺、所述单克隆细胞PCR产物和所述标准分子量内参DNA混合，变性后置于测序仪上进行毛细管电泳，结果使用Genemapper软件进行数据分析，直接获得PCR产物的大小，与野生型对照的PCR产物大小进行比较后，得出碱基插入或缺失的具体数目。