[发明专利]一种重组人PCSK9蛋白在CHO‑K1细胞中的表达纯化方法

摘要

本发明属于生物技术构建领域，具体公开了一种重组人PCSK9蛋白在CHO‑K1细胞中的表达纯化方法，包括真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His的构建，CHO‑K1细胞的转染，细胞培养，重组人PCSK9蛋白的纯化等步骤，其中重组人PCSK9蛋白的纯化采用亲和层析、尺寸排阻层析、阴离子交换层析三步，获得的重组蛋白纯度更高，更加利于研究其功能和性质，减少PCSK9蛋白抑制剂筛选过程中的干扰。

主权项

一种重组人PCSK9蛋白在CHO‑K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His的构建根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV‑C‑His，得到真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His；S2，CHO‑K1细胞的转染培养CHO‑K1细胞汇合度达到80％时，用真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His转染CHO‑K1细胞；S3，细胞培养、表达CHO‑K1细胞转染后传代培养，在CHO‑K1细胞表达出重组人PCSK9蛋白，得到CHO‑K1细胞培养液；S4，重组人PCSK9蛋白的纯化S41，亲和层析S411，取Ni Sepharose excel树脂，装配成亲和层析柱，用BufferⅠ平衡Ni Sepharose excel树脂；S412，取CHO‑K1细胞培养液，流经平衡好的Ni Sepharose excel树脂；S413，用BufferⅠ继续平衡Ni Sepharose excel树脂；S414，用BufferⅡ洗脱Ni Sepharose excel树脂，收集亲和层析洗脱液；S415，用截留分子量30KD超滤管将亲和层析洗脱液浓缩，得到浓缩液；S42，尺寸排阻层析S421，取Superdex 200 prep grade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，用Buffer Ⅲ平衡Superdex 200 prep grade树脂；S422，用所述浓缩液流经Superdex 200 prep grade树脂，收集流出液；S423，用截留分子量30KD超滤管对15mL流出液进行溶液过滤，直至溶液的电导率值小于5mS/cm，弃去滤出液，收集截留液；S43，阴离子交换层析S431，取Q sepharose Fast flow树脂，装配成阴离子交换层析柱，BufferⅣ平衡Q sepharose Fast flow树脂；S432，将所述截留液流经Q sepharose Fast flow树脂；S433，用BufferⅣ继续平衡Q sepharose Fast flow树脂；S434，用BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow树脂；S435，用BufferⅥ洗脱Q sepharose Fast flow树脂，收集阴离子交换层析洗脱液；S436，用截留分子量30KD超滤管对阴离子交换层析洗脱液进行浓缩脱盐，得到纯化的重组人PCSK9蛋白；其中，BufferⅠ、BufferⅡ均由NaH2PO4、咪唑、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4；BufferⅢ、BufferⅣ、BufferⅤ、BufferⅥ均由NaH2PO4、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4。