[发明专利]检测食品中副溶血弧菌的RPA特异性引物及试剂盒与应用

摘要

本发明公开一种检测食品中副溶血弧菌的RPA特异性引物及试剂盒与应用，属于生物技术领域。该RPA特异性引物的序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示，扩增内标的序列如SEQ ID No：8所示。本发明用时短：PCR反应通常耗时2～3个小时，RPA技术仅需要20min即可完成扩增。常温下即可扩增：只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备。结果易于判断，不像LAMP产物的弥散带，RPA仅需1对引物即可完成扩增，扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带。含扩增内标，能指示RPA反应的假阴性。

主权项

1.一种检测食品中副溶血弧菌的RPA-IAC方法，其特征在于包括如下步骤：/n（1）提取待测样品DNA；/n（2）利用RPA特异性引物构建合成扩增内标；/n（3）将扩增内标克隆到载体Mach1-T1，质粒命名为pYHL-1；/n（4）以待测样品DNA为模板，利用RPA特异性引物和pYHL-1进行RPA反应，得到RPA扩增产物；/n（5）向步骤（4）得到的RPA扩增产物中加入体积比为1:1的苯酚/氯仿溶液，混匀、离心，取上清液，进行琼脂糖凝胶电泳检测；/n扩增产物电泳目标判定区内既出现426bp特异性条带又出现331bp扩增内标条带时，则判定为含有副溶血弧菌；扩增产物电泳目标判定区内只出现426bp特异性条带而没有出现331bp扩增内标条带时，则判定为含有副溶血弧菌；扩增产物电泳目标判定区内只出现331bp扩增内标条带而没有出现426bp特异性条带时，则判定为无副溶血弧菌；扩增产物电泳目标判定区内既无331bp扩增内标条带也无426bp特异性条带时，则检测结果为假阴性；/n所述RPA特异性引物的序列如下：/n上游引物F14：5′-ACTCGTATGAGAACGTGACATTGCGTATTT-3′；/n下游引物R14：5′-TTGAACTCAGAAGGAGAAACAAGCAGGTAG-3′；/n所述的扩增内标的序列如SEQ ID No：8所示。/n