[发明专利]家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法，制备方法包括以下步骤：第一步、GAPDH/pET‑28a原核表达载体构建：（1）家蚕RNA提取；（2）反转录；（3）PCR扩增；（4）GAPDH/pMD‑19T构建；（5）GAPDH/pET‑28a重组质粒构建；第二步、GAPDH融合蛋白的原核表达；第三步、GAPDH多克隆抗体的制备；制备的GAPDH多克隆抗体特异性高、成本低、周期短，不仅为进一步获得可商品化的GAPDH抗体奠定基础，为家蚕及其他近源昆虫蛋白的功能研究提供有力工具和技术支撑，同时也弥补市场上商品化内参抗体大多来源于哺乳动物的缺陷，增加内参抗体的多样性和选择性。

主权项

一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步、GAPDH /pET‑ 28a原核表达载体的构建：（1）家蚕RNA提取；（2）反转录：以RNA为模板，反转录合cDNA；（3）PCR扩增：设计一对引物：上游引物GAPDH‑BamH I：5＇‑ATGGATCCATGTCAAAAATTGGAAT‑3＇；下游引物GAPDH‑EcoR I：5＇‑GCGAATTCTTAATCTTTAGATTGAAT‑3＇；以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；（4）GAPDH/pMD‑19T构建：将回收的目的片段与pMD‑19T载体按照摩尔比3：1用Solution I连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得GAPDH/pMD‑19T；（5）GAPDH/pET‑28a重组质粒构建：测序正确的GAPDH/pMD‑19T采用BamH I和EcoR I进行双酶切，切胶纯化回收目的片段，纯化的目的片段与pET‑28a载体以摩尔比3：1用T4 DNA连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和酶切鉴定，得到GAPDH/pET‑28a重组质粒；第二步、GAPDH融合蛋白的原核表达：将重组质粒GAPDH/pET‑28a转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，37℃，220r/min振荡培养过夜；次日，按照体积比1：100的比例接种到100ml新的含有卡那霉素培养基中，37℃，220r/min至OD600值为0.6‑0.8时，按体积比1：1000的比例加入终浓度为0.4mmol/L IPTG，37℃，220r/min，3h，诱导目的蛋白表达，收集诱导后有目的蛋白表达的菌液，用pH7.4，50mmol/L Tris‑HCl 缓冲液重悬，超声破碎后的样品4℃，12000r/min离心5min，得上清和沉淀，沉淀纯化后得纯化后的GAPDH融合蛋白；第三步、GAPDH多克隆抗体的制备：将纯化后的GAPDH融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，在新西兰纯种大白兔双肩周围皮下进行多点注射，注射前取少量正常血清作为阴性对照；首次免疫10天后，以相同抗原与等体积的弗氏不完全佐剂1：1充分混合进行第2次免疫，之后每隔7‑10天免疫1次，免疫3次后取少许血清检测免疫效果，经4次免疫 10 天后，进行心脏采血，分离血清，得到GAPDH多克隆抗体。