[发明专利]一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法

摘要

本发明公开了一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法，包括如下步骤：1)cfDNA提取；2)去磷酸化；3)变性为单链cfDNA；4)和3’端单链DNA接头进行分子间的单链连接；5)延伸：所得的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸；6)获得的双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；7)PCR扩增：以获得的完整双链DNA接头连接产物为模板，以3’端和5’端两端接头已知序列为正反向引物，进行PCR扩增；8)用磁珠法进行PCR产物纯化，回收文库。本发明原cfDNA富集效率高，可有效的检测双链、单链和受损伤的DNA。

主权项

1.一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)cfDNA提取；2)提取的cfDNA在磷酸酶的作用下去磷酸化；去磷酸化反应体系包括：SAP1μl；SAP缓冲液2μl；cfDNAxμl，0＜x＜20；ddH₂O加至总20μl；反应条件为37℃反应30‑60min，然后65℃反应15‑30min进行磷酸酶的灭活；3)变性处理：95±2℃高温处理，将原来双链的cfDNA变性为单链cfDNA；4)3’端接头连接：在步骤3)所得的单链cfDNA产物和3’端单链DNA接头进行分子间的单链连接；连接反应的连接酶是TS2126RNA ligase 1；连接反应体系包括：单链cfDNA产物，1‑5倍摩尔浓度的3’端接头量，5‑15Vol％的PEG6000，25mM ATP，2.5mM MnCl₂，RNA ligase 1缓冲液，0.1mg/ml的TS2126 RNA ligase1；连接反应的反应条件为65℃反应1‑2.5h；3’端接头序列5'PHO‑GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG‑3'ddC,该接头序列5'端磷酸化修饰，3'端双脱氧修饰；5)延伸：在步骤4)所得的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物；6)5’端接头连接：在步骤5)获得的双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；连接反应的连接酶为T4DNA ligase；5’端接头的上链序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT下链序列则是上链序列的反向互补，上链序列的T是突出末端；7)PCR扩增：以步骤6)获得的完整双链DNA接头连接产物为模板，以3’端和5’端两端接头已知序列为正反向引物，进行PCR扩增；8)用磁珠法进行PCR产物纯化，回收文库。