[发明专利]金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法，包括外植体的处理和活化、金刚砂创伤处理及农杆菌浸染、共培养、抑菌和筛选培养、抗性愈伤成苗培养、生根培养等过程。本发明步骤简单，易操作，以成熟的狗尾草种子为外植体，种子经发芽活化处理后，用金刚砂辅助造成伤口，进行农杆菌转化，大大提高了狗尾草的转化效率，缩短了转化周期，简化了转化程序，扩大了转化品系的范围，为狗尾草建立了一种灵活、周期短、高效的转基因技术体系。

主权项

一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法，其特征在于，其具体步骤如下：1)、外植体的处理和活化选取经休眠处理的狗尾草干燥成熟种子，将去除种皮后的种子装入离心管，用有效浓度为1～3％的次氯酸钠溶液灭菌消毒处理，无菌水清洗后，按质量体积比：种子：芽诱导液体培养基＝1:6～8的比例在离心管中加入芽诱导液体培养基，振荡培养1～7天，培养条件：光培养，培养温度24～26℃；所述芽诱导液体培养基是以MS培养基为基础培养基，其中微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，并添加激素；所述激素是2,4‑D、Dicamba、KT、6‑BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下；2)、金刚砂创伤处理及农杆菌浸染按照种子体积称取等量的中等目度的金刚砂，高温灭菌处理，倒掉离心管中的芽诱导液体培养基，加入金刚砂,然后加入少量含有0.6～1.0OD600nm农杆菌的浸染培养基,在涡旋振荡器下高速处理2～3分钟，再加入含农杆菌的浸染培养基，使含农杆菌的浸染培养基的总体积为种子体积的8～12倍，低速振荡浸染0.5～1小时，培养条件：光培养，培养温度24～26℃。所述浸染培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，微量元素含量加倍，PH值为5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮20～60mg/L、表面活性剂0.1～1％；所述激素是2,4‑D、Dicamba、KT、6‑BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下；3)、共培养将浸染后的种子接到带滤纸的共培养培养基上，暗培养3～9天，培养温度在20～28℃之间；所述共培养培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮20～60mg/L；所述激素是2,4‑D、Dicamba、KT、6‑BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下；4)、抑菌和筛选培养将共培养后的种子接到抑菌和筛选培养基上进行筛选，筛选分两个阶段：第一阶段，先在抑菌和筛选培养基中添加筛选剂的半致死计量，筛选1周；第二阶段，将经过第一阶段筛选的种子继代到添加筛选剂全致死计量的抑菌和筛选培养基中，筛选3～4周；培养条件：先暗培养，最后1～2周光培养，培养温度24～26℃；所述抑菌和筛选培养基是以MS培养基为基础培养基，其中微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，添加激素、抑制农杆菌的抗生素100～500mg/L；所述激素是2,4‑D、Dicamba、KT、6‑BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下；5)、抗性愈伤成苗培养将经过筛选阶段诱导的胚性愈伤组织继代到成苗培养基上，培养条件：光培养，培养温度24～26℃，培养时间2～4周；所述成苗培养基是以MS培养基为基础培养基，其中有机元素和微量元素含量加倍，蔗糖15～20g/L，pH值为5.0～6.0，添加激素、抑制农杆菌的抗生素100～500mg/L，不添加或添加筛选剂半致死计量；所述激素是2,4‑D、KT、6‑BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下；6)、生根培养将在成苗培养基上再生的达到1cm以上的芽单独取出，接到生根培养基上生根，培养条件：光培养，培养温度24～26℃，培养时间1～2周；所述生根培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，蔗糖含量减半，pH值为5.0～6.0，添加筛选剂半致死计量，添加或不添加IBA，其添加量为：10mg/L以下。