[发明专利]一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，在特定疾病的单拷贝待测基因以外，引入另一个单拷贝基因作为参比基因，在理想情况下，待测基因和参比基因的两种荧光信号的拷贝数比值应为11，然而实际扩增中，引物、探针等因素引起的基因间扩增效率的不同引起芯片微孔内的拷贝数不一致，进而导致了上述拷贝数比值为偏离A且偏离了11，本发明构建了与疾病待测基因和参比基因序列均高度相似的载体作为内参，待测基因和参比基因中载体的拷贝数的比值理论值为11，实际扩增出现了偏离B，多次实验确定了偏离A基本等于偏离B，可通过分别求得待测基因和参比基因的各模板的拷贝数比值来消除偏离，提高了数字PCR检测的准确性。

主权项

一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法通过如下步骤实现：(1)提取待检测者的全血基因组作为血样本模板，然后确定血样本模板的一个单拷贝基因作为待测基因，再确定血样本模板的另一个单拷贝基因作为参比基因，制备两个相同且等量的第一血样本模板和第二血样本模板；(2)设计合成包含待测基因和参比基因的序列作为载体模板，且载体模板上的待测基因数量等于参比基因的数量，制备两个相同且等量的第一载体模板和第二载体模板；(3)配置含有第一血样本模板的第一数字PCR反应混合液分散至第一芯片的微反应孔中，第一数字PCR反应混合液包括2×Mix、待测基因引物、第一血样本模板及对应的探针、水、第一载体模板及对应的探针；(4)配置含有第二血样本模板的第二数字PCR反应混合液分散至第二芯片的微反应孔中作为内参，第二数字PCR反应混合液包括2×Mix、参比基因引物、第二血样本模板及对应的探针、水、第二载体模板及对应的探针；(5)将第一芯片和第二芯片放在同一反应条件中进行PCR扩增并通过荧光信号读取值，第一芯片中得到待测基因的第一血样本模板拷贝数浓度C1和第一载体模板拷贝数浓度C2，第二芯片中得到参比基因的第二血样本模板拷贝数浓度C3和第二载体模板拷贝数浓度C4；(6)利用第一芯片中待测基因的第一血样本模板拷贝数浓度C1和第二芯片中参比基因的第二血样本模板拷贝数浓度C3的比值约等于第一芯片中第一载体模板拷贝数浓度C2和第二芯片中第二载体模板拷贝数浓度C4的比值，即约等于1的原理，得出C1矫正后的值为C3×C2÷C4。