[发明专利]一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于PCR检测领域，具体涉及一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法。

背景技术

数字PCR即Digital PCR(dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术，数字PCR技术是一种新型分子诊断技术，具有高灵敏度、高准确性、绝对定量等特点。芯片法数字PCR和普通PCR相比，特殊性在于数字PCR的反应体系被分配到芯片上的微孔内，理论上每个微孔中只含一个DNA模板片段，并在扩增结束后才对每个微孔进行荧光信号检测。基于该特殊性，当数字PCR的扩增效率较低时，某些微孔内的模板在初期循环中延伸失败，使得模板实际循环数少于理论循环数，导致最终的荧光信号成指数型降低，在芯片上体现出最终结果的偏差。该偏差降低了基于数字PCR技术的高精密度诊断试剂盒的检测灵敏度，甚至会出现漏检或假阴性结果。本专利通过在PCR反应体系中加入人工合成的矫正质粒来校正这种结果偏差，对于推广数字PCR技术、提高临床诊断准确率有着深远的意义。

发明内容

如上所述，为了克服因不同基因和引物之间扩增效率不同带来的数字PCR结果偏差，本发明提供了一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，可以减少或消除两个基因之间扩增效率不同带来的结果偏差，也可以增加检测方法对不同提取和样本处理条件的耐受能力，使结果更加可靠。

为达到上述目标提供了一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，所述方法通过如下步骤实现：

(1)提取待检测者的全血基因组作为血样本模板，然后确定血样本模板的一个单拷贝基因作为待测基因，再确定血样本模板的另一个单拷贝基因作为参比基因，制备两个相同且等量的第一血样本模板和第二血样本模板；

(2)设计合成包含待测基因和参比基因的序列作为载体模板，载体模板可以是带有待测基因和参比基因的质粒或者DNA片段，且质粒或者DNA片段上的待测基因数量等于参比基因的数量，制备两个相同且等量的第一载体模板和第二载体模板；

(3)配置含有第一血样本模板的第一数字PCR反应混合液分散至第一芯片的微反应孔中，第一数字PCR反应混合液包括2×Mix、待测基因引物、第一血样本模板及对应的探针、水、第一载体模板及对应的探针；

(4)配置含有第二血样本模板的第二数字PCR反应混合液分散至第二芯片的微反应孔中作为内参，第二数字PCR反应混合液包括2×Mix、参比基因引物、第二血样本模板及对应的探针、水、第二载体模板及对应的探针；

(5)将第一芯片和第二芯片放在同一反应条件中进行PCR扩增并通过荧光信号读取值，第一芯片中得到待测基因的第一血样本模板拷贝数浓度C1和第一载体模板拷贝数浓度C2，第二芯片中得到参比基因的第二血样本模板拷贝数浓度C3和第二载体模板拷贝数浓度C4；

(6)利用第一芯片中待测基因的第一血样本模板拷贝数浓度C1和第二芯片中参比基因的第二血样本模板拷贝数浓度C3的比值约等于第一芯片中第一载体模板拷贝数浓度C2和第二芯片中第二载体模板拷贝数浓度C4的比值，即 约等于1的原理，得出C1矫正后的值为C3×C2÷C4。

本发明所述方法的原理：首先在特定疾病的待测基因(单拷贝基因)以外，在与待测基因同血样模板中确定并引入另一个单拷贝基因作为参比基因，在理想情况下，待测基因和参比基因的两种荧光信号的拷贝数比值应为1:1，然而实际扩增中，引物、探针等因素引起的基因间扩增效率的不同引起芯片微孔内的拷贝数不一致，进而导致了上述拷贝数比值偏离了1:1，本发明构建了与疾病待测基因和参比基因序列均高度相似的载体作为内参，所述载体是均包含了待测基因和参比基因的序列，载体可以是带有待测基因和参比基因的质粒或者DNA片段，且质粒或者DNA片段上的待测基因数量等于参比基因的数量，如上所述，待测基因和参比基因中载体的拷贝数的比值理论值为1:1，实际扩增出现了偏离，通过多次实验，确定了不同操作条件下待测基因中的血样模板的拷贝数和参比基因中的血样模板拷贝数的比值约等于待测基因中载体的拷贝数和参比基因中载体的拷贝数的比值，因此可以通过分别求得待测基因和参比基因的各模板的拷贝数比值来消除这个偏离。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：1.可以减少或消除两个基因之间扩增效率不同带来的结果偏差；2.可以增加检测方法对不同提取和样本处理条件的耐受能力，使结果更加可靠。

附图说明

图1是实施例1的1号芯片的数字PCR结果的散点图，

图2是实施例1的2号芯片的数字PCR结果的散点图，

图3是实施例1的3号芯片的数字PCR结果的散点图，