[发明专利]双sgRNA文库的构建及其应用于高通量功能性筛选研究的方法有效
| 申请号： | 201610969127.3 | 申请日： | 2016-10-28 |
| 公开（公告）号： | CN106637421B | 公开（公告）日： | 2019-12-27 |
| 发明（设计）人： | 魏文胜;朱诗优 | 申请（专利权）人： | 博雅缉因(北京)生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C12N15/867;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 11535 北京知元同创知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 刘元霞;牛艳玲 |
| 地址： | 102206 北京市昌平区中关村生*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明提供构建pgRNA表达质粒文库的方法，所述pgRNA表达质粒文库当与Cas蛋白一同被引入细胞中时，可以使得基因组上两个sgRNA靶位点被切割，引起靶核酸序列的敲除，通过靶核酸序列的敲除筛选功能性的核酸序列。本发明还提供构建核酸序列敲除文库的方法，所述核酸序列敲除文库通过将本发明的pgRNA文库转入细胞获得，所述基因敲除文库可用于筛选功能性核酸序列。本发明还提供高通量筛选功能性核酸序列的方法。本发明是一种高通量CRISPR/Cas策略，可以使用多对gRNA(pgRNA)产生大量核酸序列的删除，使得能够快速鉴别功能性核酸序列。 | ||
| 搜索关键词： | 文库 核酸序列 敲除 功能性核酸 靶核酸序列 表达质粒 构建 筛选 高通量筛选 细胞 基因敲除 快速鉴别 靶位点 高通量 基因组 可用 切割 删除 蛋白 转入 引入 | ||
【主权项】：
1.构建pgRNA表达质粒文库的方法，包括：/n(1)提供初始质粒，所述初始质粒包含顺序连接的第一U6启动子、第二gRNA骨架序列编码序列和转录终止子；/n(2)通过第一步连接反应将多个“第一gRNA配对序列编码序列-间隔序列-第二gRNA配对序列编码序列”的每一个分别插入到初始质粒上的第一U6启动子和第二gRNA骨架序列编码序列之间，然后转化感受态细胞获得第二质粒混合物；/n(3)通过第二步连接反应将顺序连接的第一gRNA骨架序列、转录终止子和第二U6启动子插入到第二质粒中两个gRNA配对序列之间，然后转化感受态细胞获得pgRNA表达质粒文库；/n其中第一gRNA和第二gRNA的靶位点之间的间隔为200bp-10kb。/n
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