[发明专利]一种番茄PSY 1基因的CRISPR-Cas9体系构建及其应用有效
| 申请号： | 201610918480.9 | 申请日： | 2016-10-21 |
| 公开（公告）号： | CN106636182B | 公开（公告）日： | 2019-11-08 |
| 发明（设计）人： | 成妍;马蓉丽;焦彦生;乔宁;雷阳 | 申请（专利权）人： | 山西省农业科学院蔬菜研究所 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/82 |
| 代理公司： | 太原晋科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 14110 | 代理人： | 王瑞玲 |
| 地址： | 030001 山*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | 本发明属于基因工程和基因遗传修饰领域，涉及一种番茄PSY 1基因的CRISPR‑Cas9体系构建及其应用，包括以下步骤：根据番茄PSY 1基因的cDNA保守序列设计sgRNA的DNA序列，如SEQ ID NO.1所示；设计用于扩增sgRNA的番茄PSY 1基因目标区的引物组合；利用引物进行sgRNA扩增，并纯化扩增产物；得到含有特异性靶向番茄PSY 1基因sgRNA的CRISPR‑Cas9 Level 1载体和CRISPR‑Cas9 Level 2载体。有助于研究该基因参与番茄果实成熟过程中的作用，进一步了解番茄果实成熟的分子机理，可用于制备PSY 1基因缺失的转基因番茄，对未来培育耐贮运番茄新品种有重要作用。 | ||
| 搜索关键词： | 番茄 基因 番茄果实 体系构建 扩增 番茄新品种 特异性靶向 转基因番茄 保守序列 成熟过程 分子机理 基因工程 基因目标 基因缺失 基因遗传 扩增产物 引物组合 耐贮运 可用 引物 修饰 制备 应用 成熟 培育 研究 | ||
【主权项】：
1.一种番茄PSY 1基因的CRISPR‑Cas9体系，其特征是该体系构建方法包括以下步骤：（1）根据番茄PSY 1基因的cDNA保守序列设计sgRNA的DNA序列，该sgRNA位于番茄PSY 1基因第一个外显子上，中间具有一个酶切位点Sty I，如SEQ ID NO. 1所示；（2）设计用于扩增sgRNA的番茄PSY 1基因目标区的引物组合，其上、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示；（3）利用引物进行sgRNA扩增，并纯化扩增产物；（4）将纯化后的sgRNA扩增产物与pICSL01009: AtU6p和pICH47751连接，得到含有特异性靶向番茄PSY 1基因sgRNA的CRISPR‑Cas9 Level 1载体；（5）将步骤（4）的产物再与pICH47732:NPT II、pICH47742:cas 9、pICH41766和pAGM4723连接，得到含有特异性靶向番茄PSY 1基因sgRNA的CRISPR‑Cas9 Level 2载体。
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