[发明专利]一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，将αTCR及βTCR的基因融合为αβTCR，获得重组质粒后将αβTCR构建成穿梭质粒pMP71‑αβTCR，将αβTCR基因转染γδT细胞，采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗。本发明利用αβTCR基因转染γδT细胞与肿瘤细胞形成融合细胞制备疫苗，该肿瘤疫苗能够对肿瘤细胞特异性识别，融合细胞诱导肿瘤细胞凋亡的能力最强，并且能够激活机体受体主动免疫来治疗肿瘤。

主权项

一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)取外周血单核细胞，加入唑来膦酸1μM和人重组IL‑2400IU/mL并分离出γδT细胞；将HER2369与β2‑微球蛋白加入到细胞中，37℃，放置2h；每20min轻轻点到混匀使其充分结合，用与HER2369结合的T2细胞刺激与外周血HLA‑A2‑T细胞，刺激7‑14天后，对细胞进行稀释得到HER2特异性T细胞；(2)提取HER2特异性T细胞RNA，用提取的RNA产物进行下一步逆转录反应，将反转录的cDNA置于‑80度冰箱保存，备用，以反转录得到的cDNA为模板PCR合成TCRα‑以及TCRβ目的片段，合成的目的片段带有Not I、EcoR I酶切位点，提取的RNA产物行PCR反应，凝胶电泳检测PCR产物，参照说明书用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，或者用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，纯化后的目的片段与载体进行酶切反应，Not I和EcoR I双酶切目的片段以及载体pMP71，比例5：1，之后进行连接，16℃连接16h，65℃加热10min使酶灭活，连接产物转化至TOP10感受态细胞，以碱裂法提取得到pMP71/TCRαβ质粒；(3)用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒pMP71‑αβTCR和骨架质粒共转染293T细胞，质粒与脂质体2000的比率为1μg:1.5μl，取2x105‑5x105激活的γδT细胞，在室温下将冻存的慢病毒颗粒融化，轻轻混匀，将0.75ml慢病毒颗粒加入T细胞中，2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗体以及FITC标记的羊抗鼠F(ab')2抗体，进行流式细胞仪分析，转染成功HER2αβTCR‑γδT细胞；(4)采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗，将上述转染的HER2‑αβTCR‑γδT细胞与经80Gy射线照射后的SAOS‑2‑LUC细胞在融合介质中洗涤、重悬，细胞浓度在5×10⁶‑15×10⁶/ml，利用电融合仪进行融合得到融合细胞。