[发明专利]一种利用多菌株固定化细胞组合物连续生产4-羟基肉桂醇的方法

摘要

本发明涉及多菌株固定化细胞组合物连续生产4‑羟基肉桂醇的方法。该方法所用A菌株为重组菌株E.coli M15‑4Cl‑CCR，B菌株为重组菌株E.coli M15‑CAD；具体操作步骤如下：1、菌株培养；2、菌株的固定化，分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒；3、固定化细胞连续生产4‑羟基肉桂醇。本发明采用现代生物工程技术进行4‑羟基肉桂醇的生产，将多菌株固定化细胞组合物连续生产的方法运用于植物然代谢物的合成，具有重要的实践意义。同时建立了4‑羟基肉桂醇的高效液相色谱串联质谱检测方法，为这类芳香族聚合物提供更有效的分析手段。

主权项

多菌株固定化细胞组合物连续生产4‑羟基肉桂醇的方法，其特征在于具体操作步骤如下：1、菌株培养所用菌株为A菌株和B菌株；A菌株为重组菌株E.coli M15‑4Cl‑CCR，诱导后能高效表达融合双功能酶4Cl‑CCR，具有4Cl和CCR两种酶的催化活力，可将4‑羟基肉桂酸转化为4‑羟基肉桂醛；B菌株为重组菌株E.coli M15‑CAD；诱导后能高效表达CAD，可将4‑羟基肉桂醛转化为4‑羟基肉桂醇；LB固体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；LB液体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，琼脂粉15，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；1.1、A菌株的培养，将重组菌株E.coli M15‑4Cl‑CCR接种于LB固体培养基，活化；挑取重组菌株单菌落接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；取30mL培养液转接于1L含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养8h；1.2、B菌株的培养，将重组菌株E.coli M15‑CAD接种于LB固体培养基，活化；挑取重组菌株单菌落接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；取30mL培养液转接于1L含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养4h；2、菌株的固定化2.1、细胞的离心洗涤：取A菌株菌液 1L、B菌株菌液 1L，在转速4000rpm/min条件下，离心15min，倾去上清液，用10mL 0.9%生理盐水悬浮细胞，制得A菌株细胞悬浮液和B菌株细胞悬浮液；2.2、取A菌株细胞悬浮液10mL和B菌株细胞悬浮液10mL，与75mL 2%的海藻酸钠溶液均匀混合，使用注射器滴入150mL 2%的CaCl₂溶液中，固定化细胞颗粒直径2.5mm，4°C冰箱放置12h使其充分固化，倾去上清液，加入无菌水洗涤2次，制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于4°C冰箱中备用；3、固定化细胞连续生产4‑羟基肉桂醇3.1、100mL反应体系组成：100mL含A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒的LB液体培养基，终浓度为1mM的底物4‑羟基肉桂酸（分别为香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）；反应混合物于37°C、200rpm避光振荡反应2‑10h,反应后混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；3.2、产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB‑C18柱（2.1× 150 mm， 3.5 μm; Agilent，Santa Clara， CA，USA），流动相为乙腈，流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脱的具体条件见表1，检测波长为280 nm；质谱为配备ESI源的离子阱质谱（LCQ DECA XP MAX），质谱检测的具体条件见表2；表1. 分离底物4‑羟基肉桂酸和产物4‑羟基肉桂醇的高效液相色谱流动相梯度洗脱条件 表2. 3种底物4‑羟基肉桂酸和3种产物4‑羟基肉桂醇质谱检测条件 产物产率的计算：产率（%）=C_P/C_S×100%式中C_P为反应后4‑羟基肉桂醇的浓度，C_S为反应前底物的浓度；香豆醇、咖啡醇、松柏醇的产率分别为53.7%，22.1，56.4%。