[发明专利]一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法

摘要

本发明提供了一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，属于煤层水样微生物分析。本发明要解决的技术问题是从成分复杂的煤层水样中提取微生物总DNA的方法。本发明方法包括以下步骤：煤层水样的预处理，通过离心去除大颗粒杂质，采用膜过滤的方式收集水样中的微生物；微生物细胞破碎，将收集好微生物的滤膜剪碎后重悬在缓冲液中，用珠磨器法破碎细胞，再用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠溶液在55℃孵育2h‑4h，至溶液澄清；微生物总DNA的纯化和沉淀，用酚‑氯仿法去除杂蛋白，加入异丙醇沉淀收集总DNA。本发明的总DNA提取方法适合于成分复杂的煤层水样及相关样品，细胞破碎效果好，提取的基因组纯度高、完整性好，可直接用于后续的宏基因组学分析、DGGE分析等。

主权项

1.一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)煤层水样的预处理：取煤层水样10-20mL通过低速离心去除大颗粒杂质，低速离心转速为1000-2500×g，离心时间为5-10min，收集上清液，采用抽滤的方式将水样中的微生物收集到孔径为0.22μm的滤膜上，将滤膜剪碎后置于5-10mL STE缓冲液中，待用；所述STE缓冲液组成包括：NaCl 0.1-0.2g/L，Tris-HCl 20-40mmol/L，EDTA 0.3-0.6mol/L，溶剂为ddH₂O；/n2)微生物细胞的破碎：将含有滤膜的缓冲液移入预冷的螺旋帽管中，向螺旋帽管中添加质量为0.6-0.8g、直径为0.3mm的玻璃珠，采用珠磨器对细胞进行破碎，珠磨器的转速为1500-3500rpm，破碎时间15-45s，重复2-3次，重复过程中将上清液移至离心管后，再向螺旋帽管加满STE缓冲液，将所有上清液合并，加入终浓度为20-50mg/mL的蛋白酶K和质量体积比为5％-10％的十二烷基硫酸钠水溶液，充分混匀后置于55℃水浴锅内孵育2-4h；/n3)微生物DNA的抽提、纯化及沉淀：向孵育后的液体中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，11000-13000×g离心10-30min，取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提，除去酚类物质和脂类物质，11000-13000×g离心10-30min，收集上清液，加入1-2倍体积的异丙醇，于-20℃低温沉淀1-2h，用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，11000-13000×g离心10-30min，弃上清，室温放置至乙醇挥发完全后，加入50-150μL的TE缓冲液溶解沉淀，溶解后加入RNaseA去除RNA，得到微生物基因组总DNA。/n