[发明专利]一种食用百合的花药培养脱毒方法

摘要

本发明提供了一种食用百合的花药培养脱毒方法，该脱毒方法详细步骤包括（1）配制食用百合花药诱导培养基；（2）接种花药的选材；（3）花药消毒与接种；（4）花药诱导培养；（5）胚性愈伤分化与继代培养；（6）食用百合鳞茎的炼苗与移栽；（7）食用百合单倍体植株的剔除。本发明的食用百合的花药培养脱毒方法通过花药培养途径获得了食用百合花粉植株，进而剔除花培群体中的单倍体杂株获得食用百合二倍体植株，对脱毒植株进一步百合病毒检测发现，该脱毒方法几乎达到了100%的脱毒，生产实验进一步发现食用百合脱毒植株的产量和品质均有了极大的提升。

主权项

一种食用百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤如下：（1）配制食用百合花药诱导培养基食用百合花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02～0.03mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2‑EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；有机成分：肌醇90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，丝氨酸0.75～0.85mg/L；激素：2，4‑D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；凝固剂：植物凝胶6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白0.8～1.0g/L，活性炭0.35～0.45g/L；碳源：蔗糖55～65g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60‑80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全溶解，停止加热，调节pH为5.8‑6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（2）接种花药的选材在食用百合正常现蕾开花季节，上午取材，用冰壶带回实验室；（3）花药消毒与接种将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2‑3滴吐温‑80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，50‑65d后诱导出花药胚性愈伤；（5）胚性愈伤分化与继代培养无菌条件下将诱导成功的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25‑40天至小芽长至0.6cm以上，将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上继代培养，2‑3个月后得到直径0.8‑2.0cm 的百合小鳞茎；（6）食用百合鳞茎的炼苗与移栽将食用百合小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留物，移栽入温室内，定期喷施百合壮苗营养液来壮苗；（7）食用百合单倍体植株的剔除采用根尖压片法观察所得食用百合植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植株；步骤（2）中的筛选百合花蕾的标准为：按照花蕾长度为22～28mm、花蕾内花药中的小孢子大都处于单核期的标准选择花蕾；所述步骤（4）中花药诱导培养的培养条件控制为：温度控制为24℃‑27℃，湿度控制为65%‑80%，黑暗条件；所述步骤（5）中分化培养的培养基配方为：MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4‑D+0.25mg/L NAA；培养条件控制为：温度25℃‑28℃，湿度65%‑80%，光照为1200‑1800Lx，光周期为14h光/10h暗；所述步骤（5）中继代培养的培养基配方为：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6‑BA +0.15mg/L NAA；培养条件控制为：温度25℃‑28℃，湿度65%‑80%，光照为1200‑1800Lx，光周期为14h光/10h暗；所述步骤（6）中百合壮苗营养液的配方为：KH2PO4 0.3g/L，CaSO4 0.1g/L，MgSO4∙7H2O 0.1g/L，ZnSO4∙7H2O 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 0.6mg/L，CuSO4 0.1mg/L，MnSO4∙4H2O 0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L；将以上各成分定量充分溶解在纯净水里即成营养液；所述的百合壮苗营养液的用法为：百合鳞茎移栽时浇一次，以后每7‑10天浇一次，每次用量为50‑80ml/株百合。