[发明专利]唐菖蒲伯克霍尔德菌分子标准样品及其制备方法

摘要

本发明公开一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌分子标准样品的制备方法，其通过将提取的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的基因组核酸经冷冻干燥后获得，其中所述的冷冻干燥条件为：启动冻干机，当干燥室温度降至‑35℃时开启冷却阱；冷却阱温度降至‑40℃时，将在‑80℃预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0.5Torr结束冷冻；并将样品于15℃干燥，当真空度降至0.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得唐菖蒲伯克霍尔德氏菌基因组核酸标准样品，于‑20℃中避光贮存。本发明分子标准样品理化性质优良，可采用特异性的引物通过PCR方法检测出，灵敏度达到10^‑4倍。经检测试验，该标准品DNA完整性、均匀性、稳定性好，可用于进出口检测中，作为阳性参照物质，提高检测结果的准确性。

主权项

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌标准样品的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）基因组核酸的提取_{①唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，经菌株活化、增菌培养；②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4℃离心15min；③吸弃上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL悬浮，加0.5mL浓度为100g/L SDS和50μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h；④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加1.5mLCTAB‑NaCl混合溶液，混匀，65℃温浴20min；其中，CTAB‑NaCl混合溶液为100g/L CTAB和0.7mol/L NaCl；⑤取上清，加与上清等体积的酚\氯仿\异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，酚\氯仿\异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；⑥取上清，加与上清等体积的氯仿、异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，氯仿‑异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心10min；⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL pH8.0的TE溶液溶解，获得唐菖蒲伯克霍尔德氏菌基因组核酸溶液；（2）冷冻干燥①样品预冻：先把步骤（1）所得的核酸样品在‑80℃低温冷冻2h；②冷冻过程：置干燥室制冷，温度降至35℃时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至40℃时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程；③样品干燥：干燥室温度设置为15℃，当真空度降至0.1Torr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得唐菖蒲伯克霍尔德氏菌基因组核酸标准样品，置于‑20℃中避光贮存。}