[发明专利]一种测试NK细胞活化的受体信号通路NKG2D荧光报告系统的构建方法及应用

摘要

一种测试NK细胞活化的受体信号通路NKG2D荧光报告系统的构建方法及应用。A、应用PCR技术获得人NKG2D的胞外区基因序列和鼠NKG2D的跨膜区和胞质区基因序列，再采用重叠PCR技术将人和鼠的NKG2D基因序列连接在一起，将构建的人鼠杂合的NKG2D序列插入pLXSN16E6E7载体，成载体pLXSN16E6E7‑mhNKG2D。B、应用PCR技术获得人DAP12基因序列，将构建的人DAP12基因序列插入pLXSN16E6E7载体，成载体pLXSN16E6E7‑hDAP12。将上述两种载体质粒与逆转录病毒系统的辅助质粒pCL‑ECO共转染HEK293T细胞，获得具有再感染小鼠细胞3A9的病毒颗粒。C、将含有病毒颗粒的细胞培养上清感染3A9细胞，经过多次流式分选和再培养，筛选出稳定表达鼠人融合NKG2D和人DAP12的细胞系12A9，可在人的NKG2D配体MICA/MICB刺激下能够激活NKG2D的下游信号，使得GFP蛋白表达，可检测到细胞发绿色荧光。

主权项

1.一种测试NK细胞活化的受体信号通路NKG2D荧光报告系统的构建方法，包括载体和稳定细胞系的构建；包括步骤如下：(1)设计NKG2D特异性引物，M‑P1：CAATGACAGAATTCATGAGCAAATGCCATAATTAC、M‑H‑P2：CAAAGAGACGTTTCAGCCAGTATTATTCAACCAAG；M‑H‑P3：GTTTCAGCCAGTATTATTCAACCAAGAAGTTC；H‑P4：CCACAGCTGGATCCTTACACAGTCCTTTGCATGCAG；(2)采用PCR技术，以M‑P1和M‑H‑P2为引物获得鼠NKG2D的胞质区和跨膜区基因序列；以M‑H‑P3和H‑P4为引物获得人NKG2D的胞外区基因序列；(3)以(1)和(2)步所得的基因产物为模板，以M‑P1和H‑P4为引物获得鼠人杂合的NKG2D基因序列；(4)将(3)步构建的人鼠杂合的NKG2D基因序列插入pLXSN16E6E7质粒，构建成载体pLXSN16E6E7‑mhNKG2D；(5)设计人DAP12特异性引物，P5：CCCATCGATGCCCAGAGCGATTGCAGTTGC；P6：CGCGGATCCTCATTTGTAATACGGCC；(6)采用PCR技术，以P5和P6为引物获得人DAP12基因序列；(7)将(6)步构建的人DAP12基因序列插入pLXSN16E6E7质粒，构建成载体pLXSN16E6E7‑hDAP12；(8)pLXSN16E6E7‑mhNKG2D质粒和pLXSN16E6E7‑hDAP12质粒与逆转录病毒系统辅助质粒pCL‑ECO共转染HEK293T细胞，获得具有再感染小鼠细胞3A9的病毒；(9)将(8)步获得的病毒再感染3A9细胞，用PE标记的NKG2D单克隆抗体和FITC标记的DAP12单克隆抗体对再感染的3A9细胞进行多次流式分选和培养，获得稳定表达鼠人杂合NKG2D和人DAP12的鼠细胞系12A9；(10)细胞系12A9在人的NKG2D配体刺激下能够激活NKG2D的下游信号，使得下游的GFP蛋白表达，经荧光显微镜或流式细胞仪可检测到细胞发荧光。