[发明专利]CLCA2蛋白在人宫颈癌siha细胞中表达的检测方法及应用

摘要

本发明提供了CLCA2蛋白在人宫颈癌siha细胞中表达的检测方法及其应用，涉及分子生物学和药学应用技术领域。本发明采用异紫堇碱为前药物处理剂，结合基因芯片、RT-PCR和Western Blot等分子生物学技术，实现了宫颈癌Siha细胞中CLCA2表达的定性定量检测，经检测发现，异紫堇碱处理宫颈癌Siha细胞后能诱导CLCA2表达的上调，具有时间与剂量依赖性，且CLCA2蛋白表达上调抑制了HPVE6的表达，进而抑制其功能。本发明的研究方法表明了异紫堇碱能够通过诱导CLCA2蛋白的上调表达对宫颈癌Siha细胞起抑制作用，从而得到CLCA2可成为人宫颈癌诊断的有效分子标记物，进而得到CLCA2在治疗人宫颈癌Silia方面具有重大应用价值。

主权项

CLCA2蛋白在人宫颈癌siha细胞中表达的检测方法，其特征在于，包括以下的具体步骤：(1)利用基因芯片实验检测不同浓度的异喹啉类生物碱异紫堇碱对HPV16Siha细胞处理后差异基因表达谱的改变；以干燥秃疮花为原料，利用乙醇提取法和硅胶柱色谱分离法进行异喹啉类生物碱的提取和异紫堇碱的分离，得到异紫堇碱，SiHa细胞株生长到对数生长期，密度达80％时用浓度为800μmol/L的异紫堇碱处理，将样本分为四组，分别是：①未经异紫堇碱处理的SiHa细胞，②经异紫堇碱处理12小时后的SiHa细胞，③经异紫堇碱处理24小时后的SiHa细胞，④经异紫堇碱处理48小时后的SiHa细胞，分别以Trizol法裂解后收集样品，采用Human Transcriptome Array 2.0表达谱芯片筛选表达差异的mRNA；(2)利用RT‑PCR法检测药物干预前后细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆及特定基因的cDNA序列；以5000个/孔将细胞种进96孔板中，培养24h后，弃去旧培养液，加入浓度为800μmol/L的异紫堇定碱干预，分别培养12h，24h，48h，用BioTeke的RNA提取试剂盒抽提总RNA，首先，用枪头吸尽培养基，向各孔中加入125μl*2的Buffer，再用枪头吸尽Cell AmpTM Washing Buffer，后向各孔中加50μl的Processing溶液，反复吹打Processing液后，移至微量离心管中，75℃水浴5min，分装得到的细胞裂解液，以便后续反转录实验，同时每组均设定复孔；5μg RNA被反转录成cDNA10μl体系，其反转录体系包括：5×PrimeScript TM Buffer 2μl，PrimeScript TM RT EnzymeMix I 0.5μl，50μM Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6 mers0.5μl，RNase Free dH2O 4.5μl，cDNA 2μl，反转录条件37℃、15min，85℃、5秒，再以cDNA为模板进行特异性扩增，其扩增反应20μl体系由：Tap酶10μl，Forward primer0.4μl，Reverse primer 0.4μl，Rox 0.4μl，ddH₂O 6.8μl，and 2μl cDNA模板组成，需要扩增目的基因的引物序列和退火温度由Tablel给出，β‑actin被扩增作为对照，荧光实时PCR反应结束后，由系统分析软件确定阈值，进而确定各反应样本的CT值，采用相对定量的2‑ΔΔCT法分析PCR结果，确定各样本之间基因的表达差异；公式：ΔCT＝(CTTarget‑CTActin)ΔΔCT＝(CTTarget‑CTActin)Timex‑(CTTarget‑CTActin)TimeO2‑ΔΔCT表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。表1 引物及扩增产物的大小(3)通过Western Blot法观察HPV病毒致瘤基因E6蛋白表达的变化；细胞总蛋白以RIPA裂解液提取，蛋白定量依据Bradfords method以BSA作为标准对照，在570nm波长处测其吸光度值，计算样品中的蛋白含量后将每个样本以RIPA液稀释为5μg/μl，每个样本80μl的总蛋白与20μl蛋白上样缓冲液混匀后置于100℃沸水煮10min进行变性，蛋白电泳用80V跑浓缩胶，120V跑分离胶，每个泳道上样量为40μg/20μl，转膜采用0.45μmPVDF膜，100V恒压，4℃，1.5h，转完膜后用TBST将膜浸洗一次，放入5％脱脂奶粉‑TBST缓冲液中25℃摇床封闭1h，封闭完全后，按1∶500稀释比加入兔抗人CLCA2一抗，4℃摇床慢速震荡孵育12h，以TBST缓冲液漂洗后将膜放入按1∶10000稀释好的山羊抗兔二抗杂交液体中25℃摇床孵育2h，蛋白条带用ECL发光液进行显像，最后用X线暗盒曝光成像，蛋白条带判定由预染分子量的Marker提供参考，利用Image‑pro plus 6.0软件来分析各条带的OD值。