[发明专利]分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法

摘要

本发明提供一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法，采用无菌培养结合同位素示踪技术，研究环境因素对植物生长及氨基酸吸收的影响，确定环境因素的长期效应，之后采用短期吸收及添加代谢抑制剂的方法，研究环境因素对根系短期吸收氨基酸及吸收方式的影响，最后采用同位素示踪结合气相色谱-同位素质谱联用检测技术，确定环境因素限制甘氨酸代谢的限速步骤。本发明方法设计合理，操作简单，采用的同位素示踪技术及气相色谱-同位素质谱联用检测技术精密度和可信度较高，可有效的分析环境因素影响氨基酸营养贡献的机理。

主权项

一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)环境因子对氨基酸长期吸收的影响采用无菌营养液培养方法：以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15‑25d后，选择生长状态一致的植物，更换为3mM 5‑55％¹⁵N‑甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置光照强度、营养液pH、CO₂浓度相应的环境条件，每2‑3d更换一次营养液，培养6‑25d后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，去除吸附于根系上的¹⁵N，清洗根系，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶液清洗，最后用纯净水冲洗，干燥后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析环境因素对植物生长及氨基酸吸收的长期影响；(2)环境因子对氨基酸短期吸收及吸收方式的影响采用步骤(1)所述的无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15‑25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8‑10h，之后将其根系放置于50μmol L^‑1CCCP溶液中1小时，使其根系失活，然后以不用CCCP处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM 98.10at.％¹⁵N‑甘氨酸的营养液中，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，进行标记氨基酸的短期吸收及吸收方式试验，设置光照强度、营养液pH、CO₂浓度相应的环境条件，培养2‑6h后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，根系放于清水中清洗，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶液清洗，最后用纯净水冲洗，以去除吸附于根系上的¹⁵N，干燥后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析环境因素对根系吸收及吸收方式的影响，进而分析影响甘氨酸营养贡献的限速步骤；(3)环境因子对氨基酸在植物体内代谢的影响采用步骤(1)所述的无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15‑25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8‑24h，之后更换为3mM 50‑99.8％¹⁵N‑甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、CO₂浓度等，培养10‑24h后破坏性采样，将植物根系于清水中清洗，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶液清洗，最后用纯净水冲洗，以去除吸附于根系上的¹⁵N，干燥后，将根系和植物地上部一起放于球磨仪中粉碎；称取20mg经干燥后粉碎的植物样品，加4ml 80％乙醇放置于震荡机中以10‑30r/min震荡提取1h，提取液在3500‑4500g/min离心15min，保留上清液，残渣用1ml 80％乙醇再提取1h，10000‑12000g离心5‑15min，两次离心的上清液混合，采用N₂吹干或者低温低压旋转蒸发仪于25‑35℃下蒸干，再次用2ml 0.1mol/L HCl溶解，在10000‑15000r/min转速下离心10‑15min，上清液倾倒于体积为2cm³的阳离子交换柱中，该阳离子交换柱采用20ml超纯水清洗，其中的氨基酸采用20ml 4mol/LNH₄OH洗脱，洗脱液氮吹过夜，去除其中的NH₃，之后冷冻干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就转变为相应的叔丁基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸浓度及¹⁵N丰度采用气相色谱‑同位素质谱联用仪进行测定。