[发明专利]一种酵母融合子的制备及快速筛选方法

摘要

本发明提供一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，为了实现辅酶Q₁₀的大量生产，本发明利用原生质体融合的方法，通过对粟酒裂殖酵母与多形汉逊酵母进行融合处理，结合一种高效筛选目标酵母融合子的方法，快速高效地获得同时兼备两种酵母菌株优良特性的目标融合子，所述目标融合子同时具有生长速度快、耐高温，以及能够高效生产辅酶Q₁₀等优点。本发明所述的筛选酵母融合子的方法，是以菌体的生长性能包括生长速度和耐高温能力及目标代谢产物作为筛选标记，具体以温度耐受性和含有辅酶Q₁₀结构类似物维生素K₃的培养基作为筛选策略，可以直接高通量筛选出目标融合子。本发明方法为一种简单、快捷、高效、经济、实用安全的改良酵母方法。

主权项

1.一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)DL‑1和粟酒裂殖酵母(S.promb)2.1794为出发菌株，分别制备原生质体；2)以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为两亲本，将两亲本原生质体进行融合，得融合处理细胞；3)对融合处理细胞进行初步培养后以48℃高温培养对初步培养得到的菌株进行初筛，再结合维生素K₃选择性培养基对初筛后保留的菌株进行复筛，得目标融合菌株，维生素K₃选择培养基为添加有浓度为0.16mg/mL维生素K₃的固体YPD培养基；所述制备原生质体包括以下步骤：1.1)收集菌体：取对应出发菌株对数期菌液并通过离心收集菌体，以PBS缓冲液洗涤菌体2～3次；1.2)细胞预处理：以预处理液悬浮经过洗涤的菌体，然后于25～35℃水浴处理5～10min，处理后通过离心收集菌体；所述预处理液的制备方法为：将15～25μL 0.05mol/L EDTA水溶液以及15～25μLβ‑巯基乙醇溶于20mL PB缓冲液中；1.3)破壁：以2.0～2.5％蜗牛酶酶液悬浮步骤1.2)收集的菌体，然后于25～40℃水浴处理30～60min，使菌体细胞转变为原生质体，然后通过离心收集原生质体，然后以KCl高渗缓冲液洗涤原生质体2～3次，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液；所述融合包括以下步骤：2.1)灭活：分别将两亲本原生质体在紫外灯下照射1～5min，然后于黑暗中保存15～20min，分别得到两亲本灭活后的原生质体；2.2)分别以KCl高渗缓冲液悬浮两亲本灭活后的原生质体，得两亲本原生质体细胞悬液，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液；2.3)将两亲本原生质体细胞悬液混合后离心并收集细胞，以PEG‑CaCl₂缓冲液悬浮该细胞，然后于25～35℃水浴处理15～20min，然后通过离心收集细胞，用KCl高渗缓冲液洗涤该细胞2～3次，得融合处理细胞，所述PEG‑CaCl₂缓冲液的制备方法为：将6～8g PEG₆₀₀₀、0.8～1.0g CaCl₂以及30～50μLβ‑巯基乙醇溶于20mL PB缓冲液。