[发明专利]一种健骨药物的质量检测方法

摘要

本发明公开了一种健骨药物的质量检测方法，属于药物质量检测技术领域。采用的技术方案为该健骨药物由人工虎骨粉和辅料制成胶囊，其质量检测方法包括以下测定步骤1)将健骨药物水解后，测定样品中总氨基酸含量，每粒胶囊含总氨基酸不少于65mg；2)采用原子吸收分光光度法测定该健骨药物中总钙含量，每粒胶囊含钙不少于55mg。本发明建立采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪或者采用传统水解、PITC衍生法，使用高效液相色谱法测定制剂中总氨基酸的含量测定方法，增加了采用原子吸收分光光度法测定样品中钙的含量测定方法，保证了质量检测方法的准确性和先进性，能够有效的控制金天格胶囊的产品质量。

主权项

一种健骨药物的检测方法，其特征在于，该健骨药物由人工虎骨粉和辅料制成胶囊，其质量检测方法包括以下测定步骤：1)将健骨药物水解后，测定样品中总氨基酸含量，具体选择以下任意一种测定方法：a.采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：L‑羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸，加浓度为0.02mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：氨基酸三字代码称样量稀释倍数门冬氨酸Asp10～30mg2500苏氨酸Thr10～30mg10000丝氨酸Ser10～30mg10000谷氨酸Glu10～30mg1000甘氨酸Gly10～30mg1000丙氨酸Ala10～30mg2500缬氨酸Val10～30mg10000蛋氨酸Met10～30mg20000异亮氨酸Ile10～30mg10000亮氨酸Leu10～30mg2500酪氨酸Tyr10～30mg10000苯丙氨酸Phe10～30mg10000赖氨酸Lys10～30mg2500组氨酸His10～30mg10000精氨酸Arg10～30mg2500L‑羟脯氨酸Hypro10～30mg2500脯氨酸Pro10～30mg2500(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊中的内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中，精密加入10mL浓度为6mol/L的盐酸溶液，称定重量，置微波消解仪内于180℃水解15min，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入10mL浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液中和，并转移至100mL容量瓶中，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL置于25mL容量瓶中，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；(3)总氨基酸的测定：分别精密量取制备的对照品溶液及供试品溶液各20μL，并分别注入氨基酸分析仪，测得所述健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；b.采用传统水解、PITC衍生法，用高效液相色谱法测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及盐酸赖氨酸，加浓度0.1mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊内容物人工虎骨粉0.2g，置耐压管中，精密加入6mL浓度为6mol/L的盐酸溶液，在110℃水解24小时，冷却至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20mL，以2500转/分钟，离心5min；然后精密量取5mL上清液，并用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL置于10mL容量瓶中，用0.1N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；(3)对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取制得的对照品溶液及供试品溶液各4mL，分别置于20mL具塞试管中，并均加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2mL、1mol/L三乙胺乙腈溶液1mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8mL正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液并用0.45um有机滤膜过滤，取滤液，得到衍生后的对照品溶液和衍生后的供试品溶液；(4)测定：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；液相色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shim‑packVP‑ODS4.6mm×250mm；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇：乙腈：水＝20:60:20的混合液为流动相B；检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μL，洗脱条件如下：c.采用传统水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：精密称取L‑羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸对照品适量，加0.02mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：氨基酸三字代码称样量稀释倍数门冬氨酸Asp10～30mg2500苏氨酸Thr10～30mg10000丝氨酸Ser10～30mg10000谷氨酸Glu10～30mg1000甘氨酸Gly10～30mg1000丙氨酸Ala10～30mg2500缬氨酸Val10～30mg10000蛋氨酸Met10～30mg20000异亮氨酸Ile10～30mg10000亮氨酸Leu10～30mg2500酪氨酸Tyr10～30mg10000苯丙氨酸Phe10～30mg10000赖氨酸Lys10～30mg2500组氨酸His10～30mg10000精氨酸Arg10～30mg2500L‑羟脯氨酸Hypro10～30mg2500脯氨酸Pro10～30mg2500(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊中内容物人工虎骨粉0.2g，置耐压管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液10mL，称定重量，置110℃水解24小时，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入6mol/L的氢氧化钠溶液10mL中和，并转移至100mL容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL，置25mL容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；(3)总氨基酸的测定：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入氨基酸分析仪，测得所述健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；d.采用微波水解、PITC手动衍生，用高效液相色谱法测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、盐酸赖氨酸，加0.1mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液6mL，称定重量，置微波消解仪内于180℃水解15min，放冷至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20mL，以2500转/分钟，离心5min；精密量取上清液5mL，用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL，置10mL容量瓶中，用0.02N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；(3)对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各4mL，分别置于20mL具塞试管中，并均加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液，得到衍生后的对照品溶液和衍生后的供试品溶液；(4)测定：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；液相色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shim‑pack VP‑ODS4.6mm×250mm；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇：乙腈：水＝20:60:20的混合液为流动相B；检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μL；2)采用原子吸收分光光度法测定该健骨药物中总钙含量，具体包括以下步骤：(1)标准曲线的制备：选取100μg/mL钙单元素标准溶液，精密量取0、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别置于50mL量瓶中，并加氧化镧试液2mL，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；(2)供试品溶液的制备：精密称定本品内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中加硝酸5mL、过氧化氢1mL，于180℃消解15min，用水转移并定容至100mL容量瓶中；精密量取1mL置于50mL量瓶中，加氧化镧试液2mL，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；以相同方法制备试样空白对照品溶液；(3)测定：取空白对照品溶液及供试品溶液，照原子吸收分光光度法，在422.7nm波长处测定吸光度，计算得到健骨药物每粒胶囊中总钙含量。