[发明专利]一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法

摘要

本发明涉及一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，对异尖线虫单条线虫总DNA进行PCR扩增，获得其rDNA-ITS序列，测序后与基因库中DNA序列比较，并根据rDNA-ITS序列比较结果鉴定线虫的种类，最后通过酶切技术获得线虫的PCR-RFLP图谱并以此作为线虫鉴定的分子标签。本发明建立异尖线虫虫种分子生物学检测体系，以实现对其快速准确的鉴定，分析结果显示本发明方法判断准确，操作步骤简单，成本低、稳定性好。

主权项

一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，放入75％的酒精保存备用；b)样品总DNA的制备：将步骤a)得到的酒精中保存的异尖线虫幼虫用蒸馏水洗净后剪碎，加入500μL消化液，55℃作用12‑20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，测定浓度后置‑20℃保存；c)rDNA‑ITS区PCR扩增：以步骤b)得到的DNA为扩增模板，用针对异尖线虫rDNA保守区的引物：NC5：5’‑GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT‑3’(SEQ ID NO.1)和NC2：5’‑TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT‑3’(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增，目的片段为898‑956bp；d)PCR产物酶切分析：根据已在GenBank注册的异尖科线虫ITS序列，经DNASTAR软件分析，将步骤c)得到PCR产物用Hinf Ι和Hha Ι限制性内切酶进行RFLP分析，得到结果。