[发明专利]一种受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒及其构建方法有效
申请号: | 201410345521.0 | 申请日: | 2014-07-18 |
公开(公告)号: | CN104178460B | 公开(公告)日: | 2018-07-13 |
发明(设计)人: | 王慧萍;韦芳;王荣花 | 申请(专利权)人: | 上海市第一人民医院 |
主分类号: | C12N7/01 | 分类号: | C12N7/01;C12N15/861;A61K48/00;A61P35/00;C12R1/93 |
代理公司: | 上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268 | 代理人: | 吴桂琴 |
地址: | 200080*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | 本发明属生物医学领域,涉及溶瘤腺病毒,具体涉及一种受组织或细胞特异性启动子(转录水平)和microRNA(转录后水平)双调控的新型溶瘤腺病毒及其构建方法,构建的双调控溶瘤腺病毒比仅受组织或细胞特异性启动子调控的溶瘤腺病毒更加安全、有效;本发明构建的双调控溶瘤腺病毒能单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用,能显著提高肿瘤治疗效果并减少副作用。 | ||
搜索关键词: | 溶瘤腺病毒 双调控 构建 转录 细胞特异性 生物医学领域 肿瘤治疗效果 启动子调控 单独使用 肿瘤治疗 转录水平 启动子 安全 | ||
【主权项】:
1.一种受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒,其特征在于,以重组腺病毒(Ad)为载体,根据不同类型肿瘤的遗传特点及转录水平,选择肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子进行调控腺病毒早期复制必需元件E1基因;及根据转录后水平选择肿瘤组织和正常组织差异表达的MicroRNA,设计多个拷贝的靶序列插入到腺病毒早期复制必需基因E1的3'非翻译区(3'UTR),构建形成受转录和转录后水平双调控的溶瘤腺病毒;所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒的构建方法,包括步骤:1)通过PCR反应和克隆技术,分离肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子;2)构建携带肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子调控腺病毒早期复制必需元件E1基因的腺病毒穿梭质粒;3)设计MicroRNA靶序列的长度、拷贝数和连接序列,所述MicroRNA为miR‑145,拷贝数为4个,4个拷贝miR‑145靶序列的具体序列结构为gtt aac agg gat tcc tgg gaa aac tgg act cag agg gat tcc tgg gaa aac tgg acc tga agg gat tcc tgg gaa aac tgg act agg agg gat tcc tgg gaa aac tgg acg tt;通过PCR反应或基因合成获得上述MicroRNA靶序列;4)利用分子克隆技术将获得的MicroRNA靶序列插入到腺病毒早期复制必需基因E1表达框终止密码与polyA之间;5)构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的腺病毒骨架质粒;6)包装、扩增、纯化腺病毒,并进行病毒滴度及功能鉴定;7)病毒感染正常细胞及肿瘤细胞测定比较复制及杀伤能力,评价安全性及有效性;所述的微环境特异性启动子选自低氧诱导性基因启动子或热休克蛋白基因启动子。
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- 2016-12-01 - 2019-08-13 - C12N7/01
- 本发明提供了一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,包括将启动子插入pXC2‑Δ24中并连接到质粒中,酶切;将TSLC1基因与质粒连接,将连接产物与DH5α感受态细胞混合,酶切;将上述两个步骤得到的终产物连接,转化到含有全序列腺病毒骨架的质粒大肠杆菌中重组,产生E1A区由启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A‑CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒;腺病毒骨架DNA质粒用pacⅠ酶切线性转化后,转染到293A细胞中病毒包装,病变后,得到溶瘤腺病毒Ad.wnt‑E1A(Δ24)‑TSLC1。采用本发明的构建方法得到的溶瘤腺病毒对结肠癌细胞和肝癌细胞具有明显的杀伤效果。
- 重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法-201610898984.9
- 田新贵;周荣;蒋再学;马强;李潇;周志超 - 广州呼研所医药科技有限公司;广州呼吸疾病研究所
- 2016-10-14 - 2019-08-09 - C12N7/01
- 本发明公开了一种重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法,所述四价重组腺病毒疫苗,包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株。本发明首先通过制备包含不同六邻体基因片段在内的重组穿梭质粒,与重组人3型腺病毒基因组进行细菌内同源重组,获得六邻体基因片段被替换为7型、14型、55型的重组腺病毒基因组,转染细胞后拯救得到主要衣壳蛋白‑六邻体蛋白不同的重组人3型、7型、14型、55型重组腺病毒。纯化后按相同蛋白质含量混合,再用β‑内丙脂进行灭活,得到四价腺病毒疫苗,该四价腺病毒疫苗可以诱导出对四种血清型腺病毒的中和抗体应答,中和效价均为500‑1000。
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