[发明专利]一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法

摘要

本发明属于生物医用钛合金表面制备技术领域，首次将喷砂/酸蚀的表面处理工艺应用于Ti6Al7Nb表面的处理方法，发明出一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法。喷砂酸蚀后Ti6Al7Nb表面在微米级的孔洞中偶尔可见纳米级孔洞位于其中，增加了表面的多孔形态；促进成骨细胞在样品表面的增殖、黏附，促进成骨细胞分化；喷砂与酸蚀工艺均不需要高温、高压环境，设备简单，操作步骤简单易行。

主权项

一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法，其特征在于：本发明采取以下步骤：第一步进行预处理：将Ti6Al7Nb棒材切割成为Φ10mm×10mm的圆柱形试块，用分析纯丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗各15分钟，然后选取一个平整的底面，在自动旋转打磨仪上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂纸将选取的平面逐级打磨，直到获得划痕均匀一致的光滑表面，然后用无水乙醇超声波清洗15分钟，将经过打磨后的Ti6Al7Nb烘干后，放入干燥箱内以室温保存待用；第二步进行喷砂处理：将吸入式干喷砂机固定在台虎钳上，喷砂介质为白刚玉砂，粒度为60#，尺寸约为250‑300μm，将Ti6Al7Nb固定在平口钳上，使吸入式干喷砂机的枪头和Ti6Al7Nb表面保持一定的距离，喷射角度选择75°，将喷砂机的气压调至为0.3MPa气压，对Ti6Al7Nb表面进行喷砂处理，喷砂时间30秒，然后将喷砂处理后的Ti6Al7Nb用去离子水冲洗，再用无水乙醇和去离子水各超声清洗10分钟，烘干，得到喷砂处理的Ti6Al7Nb；第三步进行酸蚀处理：先将盐酸、硫酸和水按体积比2：12：11的比例混合，配制溶液过程中注意密封处理以防止HCl的挥发，然后将配好的酸蚀溶液加热至沸腾状态，保持温度不变；再将Ti6Al7Nb置于温度为50℃的蒸馏水中保温2分钟；然后置于加热的酸蚀溶液中，当将Ti6Al7Nb放入酸蚀溶液初期时，Ti6Al7Nb表面会有气泡产生，随着酸蚀时间的不断增加，Ti6Al7Nb表面产生的气泡越来越多，并且观察到酸蚀溶液由无色变成紫色；第四步进行清洗处理：将酸蚀处理后的Ti6Al7Nb用去离子水超声清洗10分钟，烘干，得到酸蚀出来的Ti6Al7Nb；第五步细胞增殖：调整细胞密度为1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells/disc，100ul培养基，接种4小时后每孔补加1ml完全培养基，37℃，孵育1天、3天、5天，弃旧培养基，每孔添加50ul MTT与450ul的无血清培养基的混合液，MTT浓度5mg/ml，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加750ul DMSO，吹打使结晶溶解后，37℃孵育10分钟，将溶解液转移至96孔板中每孔100ul，每孔转移96孔板中的6个孔，测OD值是490nm、570nm；第六步观察细胞在Ti‑6Al‑7Nb表面黏附形态：消化细胞，制备细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×104cells/ml，将调整好的细胞轻缓的接种到每个钛片表面，尽量不要溢出周边，每个钛片接5000个cells，100ul培养基，每接种一个钛片前都要将细胞吹打均匀，2小时后，每孔补加500ul完全培养基，沿壁缓慢滴加，待3天后2.5％戊二醛4℃固定4小时，弃戊二醛，无水乙醇梯度脱水50％、70％、90％、100％，两次，每个梯度脱水30分钟，完全干燥后送检，喷金；第七步成骨细胞在Ti‑6Al‑7Nb表面黏附：消化细胞，制备细胞悬液，计数浓度调整至1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells，100ul培养基，待4小时后每孔添加1ml完全培养基，待12小时、24小时、48小时后去除旧培养基，PBS冲洗三次，每孔加500ul染色剂calcein‑AM1mmol/l，37℃下孵育15分钟；第八步成骨细胞在Ti‑6Al‑7Nb表面分化：消化细胞，制备细胞悬液，计数调整细胞密度为6×104cells/ml，每个钛片表面接种6000cells/disc，100ul培养基，每组3个样品，待4小时后补加全培养基2ml/每孔，37℃孵育1天、7天，待1天、7天后将钛片表面的细胞用0.25％的胰酶消化2‑3分钟，加培养基终止消化，用移液器轻轻吹打，将所有液体转移至离心管中，然后1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加入1ml PBS轻轻吹打，再次离心1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，在沉淀细胞中加入0.4ml PBS轻轻吹打，超声破碎，将离心管置于超声水浴锅中每3‑5秒，超声一次，间隔4次，每次间隔时间30秒左右，去100μl细胞破碎悬液，置于酶标板上测量520nm波长下的OD值。