[发明专利]一种基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法

摘要

本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四种突变的方法，能够避免假性结果产生、灵敏度高、适应范围广、节省耗材和时间。针对四种突变分别设计的上游引物:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’；设计的一条共通的下游引物:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’设计的一条共通的TaqMan荧光探针：5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’。

主权项

一种基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下环节：(1)引物及荧光探针设计：针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G这四种突变分别设计等位基因特异性引物，均作为上游引物，序列如下:Y537S:5’‑GAACGTGGTGCCCCTCcC‑3’Y537C:5’‑GAACGTGGTGCCCCTgTG‑3’Y537N:5’‑AGAACGTGGTGCCCCaCA‑3’D538G:5’‑ACGTGGTGCCCCTCTATtG‑3’其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性；针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下:Rp:5’‑CACGGCTAGTGGGCGC‑3’针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下:Probe:5’‑FAM‑CTGGAGATGCTGGACGCCCAC‑BHQ2‑3’针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列如下:ALB Fp(上游引物):5’‑TGTTGCATGAGAAAACGCCA‑3’ALB Rp(下游引物):5’‑GTCGCCTGTTCACCAAGGAT‑3’ALB Probe(探针):5’‑HEX‑AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA‑BHQ2‑3’其中，FAM为6‑carboxyfluorescein；HEX为6‑carboxy‑hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher‑2；(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；(3)建立荧光实时定量PCR反应体系：以反应体系总量为20μL计，在同一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因特异性上游引物250nM‑500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM‑500nM，Y537N等位基因特异性上游引物250nM‑500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM‑500nM，下游引物(Rp)250nM‑500nM，TaqMan荧光探针100nM‑250nM，以及ALB基因特异性上游引物250nM‑500nM、下游引物250nM‑500nM、探针100nM‑250nM、2×Realtime Mastermix10μL、待测样本基因组DNA10‑50ng，使用PCR等级的H₂O补足体积20μL；(4)结果判定:将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的ESR1基因与ALB基因的扩增指标(Ct值)，即FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定。