[发明专利]虫媒病毒液相芯片三重检测方法

摘要

本发明公开了一种虫媒病毒液相芯片三重检测方法，即针对基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热和裂谷热病毒三种虫媒病毒分别设计特异性引物和探针，通过单重PCR和克隆测序，确定了引物和探针的特异性后，进行多重PCR扩增，在扩增反应体系中，上下游引物的浓度比为1:1-1:8；然后将探针与荧光编码微球偶联制得微球混合液并通过偶联探针进行偶联质量控制；最后将多重PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉素-藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。本发明检测特异性好，可以同时检测三种虫媒病毒；由于在多重PCR扩增过程中，采用不对称PCR的扩增方法，本发明检测灵敏度高。

主权项

虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1) 设计引物并对下游引物进行生物素标记，在引物特异性验证成功后，进行虫媒病毒多重PCR扩增，其中所述虫媒病毒为基孔肯雅病毒CHIKV、克里米亚‑ 刚果出血病毒CCHFV和裂谷热病毒RVFV三种，其中多重PCR扩增反应体系为： 反应条件为：95 ℃，10 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃，10 min；4℃，hold；所述混合引物为上下游引物的混合物，上下游引物的浓度比为1:1‑1:8；反应体系中所述模板可以为模板1、2、3种的任意一种或任意两种组合或三种；2) 设计核酸探针并进行氨基化修饰，与荧光编码微球偶联制得微球混合液；3) 设计偶联质控探针并加入到步骤2）得到的微球混合液进行偶联质量控制，所述偶联质控探针序列与步骤2）所述核酸探针序列互补；4) 将PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉素‑藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。