[发明专利]一种白细胞介素-24突变体及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种白细胞介素‑24突变体及其制备方法和应用，白细胞介素‑24突变体基因序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用如SEQ ID NO：2所示的基因序列，用基因工程菌重组表达白细胞介素‑24，发酵所得菌体经破碎离心得到含有白细胞介素‑24突变体的包涵体，所得包涵体经包涵体洗涤缓冲液洗涤两次或多次，并对包涵体进行变性与复性，得到白细胞介素‑24纯度达79％的白细胞介素‑24突变体。与现有技术相比，本发明制备得到了白细胞介素‑24突变体，且获得的白细胞介素‑24在治疗恶性黑色素瘤疾病表现出较大的应用前景。

主权项

一种白细胞介素‑24突变体的制备方法，其特征在于，白细胞介素‑24突变体的基因序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用如SEQ ID NO：2所示的基因序列，用基因工程菌重组表达白细胞介素‑24突变体，发酵所得菌体经破碎离心得到含有白细胞介素‑24突变体的包涵体，所得包涵体经包涵体洗涤缓冲液洗涤两次或多次，并对包涵体进行变性与复性，得到纯度达79％的白细胞介素‑24突变体；如SEQ ID NO：2所示的基因序列是通过以下方法得到的：在如SEQ ID NO：3所示的序列5′‑端TIR序列引入10个突变，所述突变是同义突变，突变位点如下：用基因工程菌重组表达白细胞介素‑24突变体时，所采用的突变引物为mIL24‑F和IL24‑R，表达质粒为pET‑32a(+)：引物mIL24‑F含有NdeⅠ酶切位点，序列为：GGGAATTCCATATGGCTCAAGGTCAAGAATTCCATTTTGGTCCGTGTCAAGTTAAAGGTGTTGTTCCCCAGAAACTGT，划线处CATATG为Nde I酶切位点；引物IL24‑R含有Xho I酶切位点，序列为：CCGCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGC，划线处CTCGAG为Xho I酶切位点；所述的包涵体洗涤缓冲液共有两种：洗涤缓冲液I：含有20mM Tris‑HCl、体积百分比1.0％Triton X‑100及2M Urea，pH为8.5；洗涤缓冲液II：含有20mM Tris‑HCl、体积百分比2.0％Triton X‑100及4M Urea，pH为8.5；对包涵体进行变性的变性缓冲液含有20mM Tris‑HCl、8M Urea及0.2M Arg，变性缓冲液的pH为11.0；对包涵体进行复性采用透析复性法，每间隔4h换一次复性缓冲液，所使用的复性缓冲液如下，复性缓冲液1：含有20mM Tris‑HCl、4M Urea、0.1M Arg、2mM GSH及0.2mM GSSG，pH为10.0；复性缓冲液2：含有20mM Tris‑HCl、3M Urea、0.05M Arg、1mM GSH及0.1mM GSSG，pH为9.0；复性缓冲液3：含有20mMTris‑HCl、2M Urea、0.025M Arg、0.5mM GSH及0.05mM GSSG，pH为8.5；复性缓冲液4：含有20mM Tris‑HCl、1M Urea、0.0125M Arg、0.025mM GSH及0.025mMGSSG，pH为8.5；复性缓冲液5：含有20mM Tris‑HCl，pH为8.5。