[发明专利]一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法

摘要

本发明公开了一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法。该方法从抗肿瘤的淋巴细胞和来自癌症患者的外周血单个核细胞提取RNA样品，然后合成cDNA；再利用通用引物和T细胞受体特定引物来扩增T细胞受体β链基因可变区段；扩增后的T细胞受体β链基因可变区段产物，经纯化后克隆到pcDNA3.1／TA载体。然后克隆的载体转化到感染态细菌细胞，培养形成单克隆细菌群落。单克隆细菌群落进一步进行液体培养，分离纯化质粒DNA，用TCR-CB-50R引物进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定；或者单克隆细菌群落不经液体培养直接进行测序；最后进行序列比对，确定输入癌症患者体内的抗肿瘤淋巴细胞是否在病人存活，从而早期判断肿瘤免疫治疗的效果。

主权项

1.一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法，其特征是，其步骤如下：(1)取五百万用于肿瘤免疫治疗的抗肿瘤淋巴细胞备用；在肿瘤免疫治疗之前、治疗后的7天、一个月和两个月，从癌症病人静脉抽取10毫升外周血，置于抗血凝的试管，4℃短暂保存；(2)根据产品使用说明书，用淋巴细胞分离液从(1)所述外周血分离外周血单个核细胞；(3)使用美国QIAGEN公司的RNeasy试剂盒和产品使用说明书，从五百万抗肿瘤淋巴细胞和外周血单个核细胞中提取总RNA；(4)取每个样品100微克总RNA，使用美国CLONTECH公司的5’-RACE试剂盒和产品使用说明书，用5’-RACE CDS引物合成cDNA；(5)将2.5微升cDNA产物与1毫摩尔dNTP底物、0.4微摩尔3’TCRBCN引物、一倍浓度扩增缓冲液和DNA聚合酶混合，在PCR扩增仪进行94℃30秒和72℃2分钟热循环5次，然后94℃30秒、65℃30秒和72℃2分钟热循环25次，最后在72℃保温10分钟，得到T细胞受体β链基因可变区段；(6)使用美国Zymoclean公司的DNA凝胶回收试剂盒并根据产品说明书对T细胞受体β链基因可变区段进行DNA纯化；纯化后，使用美国Invitrogen公司的TA克隆试剂盒并根据产品说明书，将纯化后产物克隆到pcDNA3.1／TA载体；(7)将克隆的载体通过化学转导法将其转化到TOP10感染态细菌细胞，在LB细菌平板培养基上37℃过夜培养16小时后形成单克隆细菌群落；(8)挑选单克隆细菌群落，将一个细菌菌落转入1.5毫升LB液体培养基中，然后37℃震荡培养，转速为每分钟250转；液体培养15小时后，使用美国QIAGEN公司的质粒DNA分离试剂盒并根据产品说明书，从细菌中分离纯化质粒DNA；(9)将从细菌中分离纯化的质粒DNA，用TCR-CB-50R引物对其进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定；或者(7)所述单克隆细菌群落不经液体培养直接进行测序；(10)序列分析：序列测定后的T细胞受体β链基因可变区段，与已知的T细胞受体β链基因可变区段基因库进行序列对比，以确定T细胞受体β链基因的特定种类；从而确定抗肿瘤淋巴细胞和外周血单个核细胞的T细胞组成。