[发明专利]一种改进的斑马鱼药物代谢模型建立方法

摘要

发明涉及一种改进的斑马鱼药物代谢模型建立方法，具体包括步骤：（1）利用斑马鱼代谢模型富集代谢产物。（2）利用现代色谱或其联用技术分离、分析前述步骤中斑马鱼富集的代谢成分，捕获或敲除目标成分或代谢物。（3）斑马鱼受精卵的收集。（4）取受精后3天斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中给药。（5）斑马鱼骨骼染色。（6）斑马鱼染色骨骼的检测与分析。本发明中的斑马鱼幼鱼骨质疏松模型适于中药成分如量微成分抗骨质疏活性的在体高效评价，斑马鱼成鱼代谢模型代谢产物简单、高效富集，现代色谱及其联用技术为中药复杂体系及代谢成分的分离、分析提供有力保障。本发明方法得到的模型具有中药原形成分与代谢成分的分离、分析与在体抗骨质疏松活性评价一体化，简单、高效的突出优点。

主权项

一种改进的斑马鱼药物代谢模型建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： （1）利用斑马鱼建立代谢模型，富集代谢产物  取斑马鱼成鱼数十条，分别置于含有20~30mL溶液的玻璃瓶中，随机分成数组，每组数条至数十条鱼；其中一组为0~0.5% DMSO纯净水鱼组即空白鱼组，其余为测试成分的0~0.5% DMSO纯净水溶液鱼组即药物鱼组；同时设未加鱼的空白药物组，即测试成分的0~0.5% DMSO纯净水溶液；空白鱼组、药物鱼组分别于斑马鱼暴露溶液后24h~48h时将鱼取出，用纯净水迅速洗涤3次，处死，称重，于‑70℃冰箱放置；空白鱼组、药物鱼组的24h~48h时溶液分别混合，于‑70℃冰箱放置；空白药物组于0h，24h~48h时同法取药液；药液处理：将合并后的合组药液分别冷冻干燥或减压浓缩或氮气吹干，残渣加适量50%~100%甲醇溶解，过0.22~0.45μm滤膜，滤液进行色谱联用分离、分析；斑马鱼体处理：将各组斑马鱼剪碎，混合，称重，加5倍量生理盐水匀浆，3000~4000r/min离心15min，上清液用3~5倍量甲醇或乙腈除蛋白，3000~4000r/min离心15min，上清用氮气吹干或减压浓缩至近干，残渣加适量50%~100%甲醇溶解，过0.22~0.45μm滤膜，滤液进行色谱联用分离、分析；（2）利用现代色谱或其联用技术分离、分析成分采用HPLC或LC/MS分离、分析步骤(1)中斑马鱼富集的代谢成分，捕获或敲除目标成分或代谢物，去除有机溶剂后用适当的溶媒溶解，配制成不同浓度，供斑马鱼骨质疏松模型进行活性筛选；（3）收集斑马鱼受精卵控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在 14‑12小时：10‑12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26℃‑30℃恒温培养箱中培养；（4）给药方案取受精后3天斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基0.1‑2mL，每个孔里放1‑10条幼鱼，分为数组，每组10‑15条鱼，溶媒阴性对照1组和模型药物数组，从受精后4天或受精后5天开始加入溶媒、模型药物和含有模型药物的测试药溶液，方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与模型药物、药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26℃‑30℃恒温培养箱中培养，培养周期5‑6天，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9‑10天；（5）斑马鱼骨骼染色将斑马鱼置于MS‑222(100 mg/L)中麻醉致死，去除MS‑222溶液，然后将幼鱼固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2~‑24h，将固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于PBS溶液中洗涤3次，每次10min，然后置于含1% ~ 3%H2O2和1%KOH的混合溶液中漂白30 min~2 h，至斑马鱼眼部色素清除后去除漂白液，再用PBS洗涤幼鱼3次，每次10 min，将幼鱼置于茜素红染色液中数小时至过夜，去除染色液后，依次通过3:1、1:1、1:3的1%KOH和甘油的混合溶液透明幼鱼，最后保存于纯甘油中；（6）斑马鱼染色骨骼的检测与分析用倒置显微镜观察步骤(5)中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置；用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行t‑检验。