[发明专利]毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法

摘要

本发明公开了一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，本方法是以脂肪酶基因、重组载体和酵母宿主为出发材料，利用酵母重组表达和高密度发酵，基于高效胞内表达脂肪酶制备重组毕赤酵母全细胞，同时结合通透性处理，将通透型酵母全细胞应用于生物柴油催化，制备高得率的生物柴油。本发明的重组毕赤酵母全细胞催化剂，制备过程简易，无污染，是一种绿色制备生物柴油的优良生物催化剂；重组毕赤酵母全细胞催化剂，能适应广谱油源，具有良好的短炼醇耐受性，相对其他全细胞催化剂，更容易通过高密度发酵而大规模制备，因此成本低廉，具有较好的经济效益和社会效益。

主权项

一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于：(1)重组及转化：通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌；所述的重组质粒为pPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为500μg/ml的博莱霉素（Zeocin）抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为Pichia pastoris KM71；(2)诱导：通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞；所述的菌体积累阶段为重组酵母工程菌在以甘油为碳源的BMGY培养基中培养，待菌体密度达到OD₆₀₀₌2时，进入脂肪酶诱导表达阶段；所述的脂肪酶诱导表达阶段是指以甲醇为唯一碳源的培养基BMMY培养基中培养，每隔24h添加1%（v/v）甲醇至培养液中，保持脂肪酶的诱导表达和菌体的进一步生长；所述的高密度生产是指由菌体积累阶段过渡到脂肪酶诱导表达阶段，需要更换新鲜培养基；需将菌体积累阶段获得的菌体室温无菌离心收获，然后将这些菌体无菌转接到脂肪酶诱导表达的新鲜培养基中，并开始每隔24h添加甲醇开始诱导并进一步大量积累菌体；所述的高效表达是指受甲醇诱导的强启动子在持续的甲醇诱导条件下驱动脂肪酶大量表达；所述的胞内为没有信号肽指引的蛋白质转运，表达生产的脂肪酶保留在胞内，而没有分泌到胞外的培养液中；所述的诱导的培养条件为：摇瓶装液量10%，摇床转速250rpm，培养温度为28‑30°C，菌体积累阶段培养时间18h，诱导表达阶段培养时间168h；所述的湿全细胞的获取条件为将诱导后的培养物4°C，4000×g离心5min，再用0.85%NaCl溶液重悬再离心两次，得到湿全细胞；(3)通透处理：采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性酵母全细胞；所述的通透处理为将湿全细胞在短链醇溶液中处理100min，然后离心收集全细胞；所述的短链醇为10%（v/v）的异丙醇；所述的冷冻干燥为湿全细胞在‑80°C下冷冻12h，然后在‑50°C下冷冻干燥72h；所述的通透性酵母全细胞为采用上述短链醇和/或冷冻干燥处理过的通透性酵母全细胞；(4)催化合成：以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系中反应合成生物柴油；所述的底物为油脂和短链醇混合物，油脂和短链醇的摩尔比为1∶6；所述的油脂为大豆油；所述的短链醇为甲醇；所述的无溶剂体系为不添加任何反应介质；通透性酵母全细胞的用量为油重量的10%；所述的油脂与短链醇的反应为转酯化反应；所述的脂肪酶为对油脂和甲醇具有催化作用的米赫毛霉Mucor miehe脂肪酶；所述的催化合成控制温度为30°C，时间为240h；进行振荡的转速为200rpm；合成反应结束后，将反应液与去离子水混均，8000×g离心10min, 上层即为生物柴油的脂肪酸酯成分，生物柴油得率为92%。