[发明专利]基于Ion ProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法及其应用

摘要

本发明属于基因测序领域，公开了一种基于Ion ProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法以及相关的试剂组合溶液。本发明的构建方法包括样品DNA提取、末端修复、片段筛选、接头连接、PCR扩增、文库检测和高通量测序等步骤。在末端修复、接头连接和PCR扩增步骤中分别采用试剂I、试剂II和试剂III。本发明的构建方法步骤精简、操作简单、试剂种类少、成本低、降低了文库的损失和浪费、提高了劳动效率。此外，本发明的构建方法可用于基于Ion ProtonTM测序平台的孕妇外周血胎儿染色体非整倍体的无创产前诊断，诊断结果准确率高且安全经济，能够帮助有效控制染色体非整倍体胎儿的出生率。

主权项

一种基于Ion ProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法，包括以下步骤：（1）样品DNA提取；（2）末端修复：将样品DNA与试剂I混合，室温下孵育进行反应；（3）片段筛选：对步骤（2）所得的混匀DNA液进行片段筛选及纯化，得到片段集中的平末端DNA片段；（4）接头连接：将步骤（3）所得到的DNA片段与试剂II、接头、特异标签序列反应后纯化，得到加了接头的DNA片段；（5）PCR扩增：将步骤（4）所得到的DNA片段加入试剂III，进行PCR扩增，纯化，得到小片段DNA文库；（6）文库检测：将步骤（5）所得到的扩增产物采用Q‑PCR和Agilent Bioanalyzer2100检测文库浓度及文库片段大小；（7）高通量测序：对步骤（6）所得到的合格文库进行高通量测序，优选采用Ion ProtonTM测序平台；其中，步骤（2）中的试剂I的pH值为7.4～7.6，溶剂为水，溶质为：5mM～20mM缓冲盐溶液、50mM～200mM可溶性盐溶液、1mM～5mM二硫苏糖醇、8mM～12mM ATP、10mM dNTPs混合液和End Repair酶；其中缓冲盐溶液为Tris‑HCl、磷酸盐溶液等缓冲盐溶液，优选为Tris‑HCl；可溶性盐溶液为NaCl、KCl等盐溶液，优选为KCl；试剂I优选pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM Tris‑HCl，100mM KCl、2mM二硫苏糖醇、10mM ATP、10mM dNTPs混合液、6U/μl End Repair酶；所述步骤（4）中的混合试剂II的pH值为7.5～7.8，溶剂为水，溶质为：20mM～80mM缓冲盐溶液、5mM～20mM MgCl2、5mM～50mM二硫苏糖醇、0.5mM～2mM ATP、2mM dNTPs混合液、DNA连接酶和Nick Repair酶；其中缓冲盐溶液为Tris‑HCl、磷酸盐溶液等缓冲盐溶液，优选为Tris‑HCl；试剂II优选pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mM Tris‑HCl、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP、2mM dNTPs混合液、400U/μl DNA连接酶和10U/μlNick Repair酶；所述步骤（5）中混合试剂III的pH值为7.6～7.9，溶剂为水，溶质为如下 终浓度物质：50mM～100mM缓冲盐溶液、18mM～30mM可溶性盐溶液、2mM～5mM MgSO4、200μM～300μM dNTPs混合液、DNA聚合酶和10mM引物混合液；其中缓冲盐溶液为Tris‑SO4、Tris‑HCl等缓冲盐溶液，优选为Tris‑SO4；可溶性盐溶液为硫酸盐溶液，优选为(NH4)2SO4；试剂III优选pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：66mM Tris‑SO4(pH8.9)、19.8mM(NH4)2SO4、2.4mM MgSO4、220μM dNTPs混合液、22U/ml重组Taq DNA polymerase及Pyrococcus species GB‑Dthermostable polymerase和10mM引物混合液。