[发明专利]一种酚类化合物肝毒性快速预测模型的构建方法

摘要

本发明属于有毒物质快速检测技术领域，具体为一种酚类化合物肝毒性快速预测模型的构建方法。本发明通过选取具有稳定遗传且细胞色素P450具有高表达的HepG2/C3A细胞系作为研究对象，选取6种自然界常见酚类化合物，分别使其作用于细胞，对细胞CYP1A线粒体去极化、ROS生成率等指标分别进行测试，结合统计学分析，最终确立预测模型。其方法简单快速，其用于预测药物的肝毒性，结果稳定，准确度提高，具有潜在的应用推广前景。

主权项

一种酚类化合物肝毒性快速预测模型的构建方法，其特征在于，选取6种以上酚类化合物，分别使其作用于HepG2/C3A细胞，对细胞CYP1A2线粒体去极化、ROS生成率、CYP1A酶活力和CYP2B3A酶活力指标分别进行测试，结合统计学分析，最终确立预测模型；具体步骤包括：(1)检测体系的建立选用HepG2/C3A细胞系，铺板后培养24‑36h，此时细胞铺板密度为10000～20000/孔，细胞代数为4～8代；其在酚类化合物的作用下，经步骤①、步骤②和步骤③重复检测，分别得到酚类化合物的线粒体去极化、ROS生成率、CYP1A酶活力和CYP2B3A酶活力4个指标的数据集；①线粒体去极化试验：细胞经酚类化合物刺激2‑3h后，加装探针罗丹明123，共同作用30‑40min左右，将孔板内液体吸出，HBSS清洗后，加酚类化合物24‑36h，后于酶标仪激发波长490nm，吸收波长535nm进行检测，得到线粒体去极化指标；②ROS生成率试验：前期加装探针DCFHDA，30‑40min后吸出，HBSS清洗后于细胞中加入酚类化合物作用24‑36h，后于酶标仪激发波长485nm，吸收波长525nm进行检测，得到ROS生成率指标；③细胞色素p450试验：7‑乙氧基试卤灵及7‑苄氧基试卤灵分别作为底物，酚类化合物作用细胞24‑36h后，吸出酚类化合物用HBSS清洗后，加入工作液，然后分别加入以上两种底物，置于酶标仪激发波长544nm，吸收波长590nm进行检测，分别得到CYP1A、CYP2B3A酶活力指标；(2)多维复杂数据指标的化学计量学可视化分析采用主成分分析的算法，先对步骤（1）中得到的4个指标的数据集进行化学计量学可视化分析，得到得分，藉此对药物样本进行分类判断，选择主成分；再对主成分的载荷进行分析，用于建立适用的参数化模型；(3)综合分析指标的建立根据步骤（2）中化学计量学可视化分析的结果，以主成分分析所得到的贡献率最大的前两个主成分的载荷为参量模型，结合主成分的载荷，对建模的标准品进行全面的聚类情况分析，规定在一定的主成分载荷范围内的样本与相近的此类标准品有类似的毒性及毒理性质，以此方法建立综合分析指标，实现预测模型的建立。