[发明专利]一种猪源成分掺假的快速试纸检测方法

摘要

一种猪源成分掺假的快速试纸检测方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：（1）结合猪源性成分特异性核酸序列DNA的金纳米粒子探针的制备，（2）检测试纸的制备，（3）疑似猪源性成分特异性核酸序列DNA’’的提取及处理方法，（4）猪源成分掺假的快速试纸检测。本发明利用金纳米粒子堆积会发生显色的光学性质，结合特异性的猪源性核酸序列，建立了特异性猪源DNA序列的探针检测体系，根据试纸条的层析显色结果实现了猪源性成分的快速鉴别，当样品中含有10%及以上的猪源性成分即可被检测出来，填补了现有的猪源性成分的快速鉴别技术空白，使得现场快速鉴别肉类掺假成为可能。

主权项

一种猪源成分掺假的快速试纸检测方法，其特征在于步骤为：（1）结合猪源性成分特异性核酸序列DNA的金纳米粒子探针的制备： 采用粒径为5~30nm，浓度为3nmol/L，表面带负电的金纳米粒子，用超纯水透析，除去合成过程中过量的柠檬酸三钠分子；取1 mL金纳米粒子溶液至1.5mLEP管，即得到3nmol/L浓度的金纳米粒子溶液，加入A260=0.27即浓度为10μg/mL的猪肉特异性核酸序列DNA 探针 10~50μL，振荡混匀，将EP管置于水浴中温育，时间为3~24h，水浴温度为25~60℃，此时核酸片段的巯基通过金硫键作用特异性的吸附在金纳米粒子表面； DNA：5’‑SH‑CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC‑3’；（2）检测试纸的制备：将DNA的互补片段DNA’修饰生物素，并按1~10nmol/L的浓度，喷在硝酸纤维素膜上，37℃干燥2h，贴在粘性塑料背板上，并在上下两端分别贴上玻璃纤维膜和吸收滤纸，裁切成3mm宽度，即为检测试纸；（3）样品中核酸片段的提取和处理：取含有疑似猪肉成分的肉类，剪碎后，准确称取0.1g置于1.5mL EP管中，加入1mL组织裂解液，组织裂解液组成为pH 7.5的10 mM Tris‑HCl、100 mM NaCl、10 mM EDTA、0.5% SDS和0.4 mg/mL proteinase K，盖上盖子，将EP管置于沸水中煮，时间为10~30min，将EP管于5000rpm离心10min，吸取上清，上清中加入等体积抽提液，抽提液组成为：酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1，混匀，静置5min，5000rpm离心 10min，吸取上层水相上清液，上清液中加入等体积冰无水乙醇，轻轻摇匀，静置15min，用吸头小心吸取析出的DNA’’形成的白色絮状物，用70%乙醇漂洗2次，加入100μL超纯水溶解，将提取的DNA’’样品进行紫外检测，确认A260/A280的数值在1.8~1.9，并用超纯水调节DNA’’浓度，使其A260=2.7，此时DNA’’浓度为100μg/mL；（4）猪源成分掺假的快速试纸检测：吸取提取处理得到的DNA’’样品10~50μL，加至1 mL的金纳米粒子探针体系，37℃温育，时间为5~30min，将试纸条的玻璃纤维膜一端插入探针体系，探针溶液在毛细作用下，开始向试纸条上端流动，如果DNA’’样品中不含猪肉DNA，则修饰有特异性猪源成分DNA的金纳米粒子会与硝酸纤维素膜上的互补DNA’进行特异性结合，出现红色可见条带；反之DNA’’样品中含有猪肉DNA时，则该DNA会与原先吸附在金纳米粒子表面的特异性核酸序列DNA进行特异性结合，金纳米粒子探针就不会再与试纸条上的互补DNA’发生结合，此时硝酸纤维素膜上就不会出现可见条带，说明检测的样品中含有猪肉DNA，且猪肉占的比例至少为10%。