[发明专利]一种室温提取拟穴青蟹呼肠孤病毒RNA方法

摘要

本发明公开了一种室温提取拟穴青蟹呼肠孤病毒RNA方法。快速而准确地检测青蟹体内呼肠孤病毒对于病毒病的预测预报和病害防治具有重要的现实意义。本发明能快速检测拟穴青蟹呼肠孤病毒RNA，其步骤是：(1)抽取青蟹血淋巴液，离心得到血细胞用于抽提RNA；(2)加入Trizol和氯仿，剧烈振荡混匀20s后静置3min，12000rpm室温下离心5min，取上清液；(3)加入等体积的异丙醇，混匀-20℃放置20min，12000rpm室温下离心5min，弃上清；(4)加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀，12000rpm室温下离心5min，弃上清，室温晾干3~5min，加入Rnase-freeddH2O溶解置于冰箱中保存备用。本发明操作简单，步骤少，无需低温条件，抽取少量血淋巴液对青蟹机体无损伤，对于病毒的早期检测具有重大意义。

主权项

一种室温提取拟穴青蟹呼肠孤病毒RNA方法，其特征在于所述方法主要有以下技术步骤：（1） 抽取青蟹血淋巴液1~1.5 mL，装入有抗凝剂的离心管中，5000‑6000 rpm离心3 min得到血细胞用于抽提RNA；（2） 往步骤（1）所得血细胞加入1 mL Trizol和0.2 mL氯仿，剧烈振荡混匀20 s后静置3 min，12000 rpm室温下离心5 min，取上清液；（3）将步骤（2）所得上清液加入等体积的异丙醇，混匀在冰箱‑20℃放置20 min，12000 rpm室温下离心5 min，弃上清液，得沉淀物；（4）加入1mL 75%的乙醇洗涤步骤（3）所得沉淀物，12000 rpm室温下离心5 min，弃上清液，沉淀室温晾干3~5 min，加入40 μL Rnase‑free ddH2O溶解置于－20℃冰箱中保存，得到拟穴青蟹呼肠孤病毒RNA。