本发明公开了一种卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用。所述的疫苗的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其制备方法为:根据internalin基因序列设计引物并进行PCR扩增,所得产物与pMD‑18T连接,转化DH5α后选出阳性克隆菌并扩大培养,提取质粒经验证得到pMD‑internalin重组质粒;再将该所得质粒和pcDNA3.1(+)质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切,酶切产物用T4DNA连接酶连接,转化DH5α,选出阳性克隆菌提取质粒经验证即得卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗。本发明所述疫苗免疫保护率较高,周期较长。