[发明专利]一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法

摘要

本发明公开一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，利用PCR扩增得到人活性颗粒酶A基因，将其插入到与原核表达载体pET24a(+)相应酶切位点中，构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21。该工程菌经IPTG诱导后可表达人活性颗粒酶A重组蛋白，重组蛋白以包涵体的形式表达。利用镍亲和层析柱可以分离得到纯度高达95％以上的重组蛋白，且该重组蛋白经BLT底物溶液进行活性测定显示出较好的酶解活性。该方法具有成本低、操作简单、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白具有生物学活性和易于纯化。

主权项

一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)获得人活性颗粒酶A的DNA片段以含有人颗粒酶A全长基因的质粒pET24a‑GzmA为模板，经PCR获得所述人活性颗粒酶A的DNA片段；b)构建重组表达质粒pET24a(+)‑aGzmA将所述人活性颗粒酶A基因的DNA片段和原核表达载体pET24a(+)分别用Nde I和Xho I双酶切后回收酶切片段，利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到所述pET24a(+)‑aGzmA重组质粒；c)获得人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)‑aGzmA/BL21将重组表达质粒pET24a(+)‑aGzmA加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素培养基培养1h后涂布于kan+LB平板，经37℃培养过夜，得到所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)‑aGzmA/BL21；d)人活性颗粒酶A重组蛋白的表达和鉴定将所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)‑aGzmA/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜后再转接于新的LB培养基中，摇菌至OD600＝0.6～0.8之间；加入IPTG诱导表达6h后于12000rpm离心2min，得到含有所述人活性颗粒酶A重组蛋白的菌体；e)人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化将所述菌体用PBS重悬，置于超声波破碎仪中进行超声破碎；离心收集沉淀，经重悬、离心，过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍柱进行亲和层析纯化，得到纯化的人活性颗粒酶A重组蛋白。