[发明专利]利用大肠杆菌原核表达系统生产的小麦蛋白质二硫键异构酶及方法和应用

摘要

本发明公开了一种利用大肠杆菌原核表达系统生产的小麦蛋白质二硫键异构酶及方法和应用。采用技术方案是：从小麦幼叶中提取小麦总RNA，经RT-PCR获取wPDI基因。将目的基因连接到载体PET-30b中，构建重组质粒。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，在LB培养基中诱导表达，培养重组大肠杆菌，离心收集菌体细胞；用超声法破碎菌体细胞后，离心后收集上清液；经一次Ni-sepharose亲和层析，获得wPDI。本发明通过大肠杆菌表达系统，实现了wPDI大量表达和简便的纯化工艺；获得的wPDI在面粉的加工品质实验中显示了良好的改善小麦加工品质的作用，可用于面粉加工中。

主权项

利用大肠杆菌原核表达系统生产小麦蛋白质二硫键异构酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）从小麦幼叶中提取小麦总RNA，通过RT‑PCR获取小麦蛋白质二硫键异构酶基因，将此基因连接到PMD‑19T载体上，从T载体上克隆的目的基因经酶切后，插入到载体质粒PET‑30b中，酶切位点分别为BamH I和Xho I，构建出表达蛋白质二硫键异构酶基因的质粒PET30b‑wPDI；（2）将质粒PET30b‑wPDI转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液OD值达到0.6‑0.8时，在低温条件下用0.5mM IPTG诱导6‑7小时后，4℃离心收集菌体细胞；（3）用超声破碎法冰浴裂解细胞，除去不溶性细胞碎片，收集上清液；将上清液过Ni‑sepharose亲和层析柱，经梯度洗脱得到带有组氨酸标签的蛋白质二硫键异构酶。