[发明专利]JEV优势抗原表位E1-402aa重组质粒的制备方法及疫苗

摘要

本发明公开了一种JEV优势抗原表位E1-402aa重组质粒的制备方法及疫苗。小鼠首免后0d、21d和56d收集血清，应用小鼠细胞因子(IFN-γ)定量ELISA检测试剂盒对其进行检测，结果显示，pCI-E1-402aa疫苗组和JEV弱毒苗疫苗组免疫小鼠后，IFN-γ的水平显著升高，说明疫苗组均具有刺激Th1淋巴细胞分泌IFN-γ的能力，且IL-7具有增强Th1型免疫应答的作用。通过分析外周血细胞因子IL-4和IFN-γ的变化趋势，疫苗可以刺激机体产生的不同亚类细胞免疫反应的能力。

主权项

一种JEV优势抗原表位E1‑402aa重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1JEV优势抗原E1‑402aa的PCR克隆；A11E1‑402aa基因的引物设计及合成；根据NCBI上公布的乙脑病毒SA14‑14‑2毒株基因序列，设计一对扩增该片段的引物：P1：GAATTCCGGGATCCGGGTCAATGTTTAATTGTCTGGGAATGGGCAATCGTG.P2：GTCGACTTACGTGCTTCCAGCTTTGTGCCAATG；A12乙脑病毒RNA的提取A13E1‑402aa基因的扩增A131mRNA的反转录A132E1‑402aa基因的PCR扩增以P1、P2为引物，扩增E1‑402aa基因，PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃40s，55℃40sec,72℃40s，35个循环后，72℃延伸10min；A14E1‑402aa基因的回收；A2pMD‑E1‑402aa质粒的构建；A21感受态细胞的制备；A22连接和转化；取pMD19‑T载体和回收的E1‑402aa的cDNA，于16℃连接过夜；A23pMD‑E1‑402aa重组质粒的鉴定；A3pCI‑E1‑402aa真核表达质粒的构建；A31E1‑402aa基因片段的酶切回收；用EcoRI和SalI对pMD‑E1‑402aa进行双酶切；A32pCI‑neo载体的酶切回收；用EcoRI和SalI对pCI‑neo进行双酶切；A33连接与转化；取酶切回收的pCI‑neo片段和酶切回收的E1‑402aa目的基因，于16℃连接过夜；A34重组质粒的鉴定；将转化好的菌扩大培养后，小量提取质粒，用EcoRI和SalI对质粒进行双酶切，用1％的琼脂糖凝胶电泳；酶切鉴定阳性的重组质粒进行测序，将测序正确质粒命名为pCI‑E1‑402aa。