[发明专利]JEV优势抗原表位E1-402aa重组质粒的制备方法及疫苗无效
| 申请号： | 201310362712.3 | 申请日： | 2013-08-16 |
| 公开（公告）号： | CN103409454A | 公开（公告）日： | 2013-11-27 |
| 发明（设计）人： | 徐志文;赵勤;朱玲;李凤琴;刘骁 | 申请（专利权）人： | 四川农业大学;四川高金食品股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;A61K39/12;A61P31/14 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 625014 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | jev 优势 抗原 sub 402 aa 重组 质粒 制备 方法 疫苗 | ||
1.一种JEV优势抗原表位E1-402aa重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1JEV优势抗原E1-402aa的PCR克隆；
A11E1-402aa基因的引物设计及合成；
根据NCBI上公布的乙脑病毒SA14-14-2毒株基因序列，设计一对扩增该片段的引物：
P1：GAATTCCGGGATCCGGGTCAATGTTTAATTGTCTGGGAATGGGCAATCGTG.
P2：GTCGACTTACGTGCTTCCAGCTTTGTGCCAATG；
A12乙脑病毒RNA的提取
A13E1-402aa基因的扩增
A131mRNA的反转录
A132E1-402aa基因的PCR扩增
以P1、P2为引物，扩增E1-402aa基因，PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃40s，55℃40sec,72℃40s，35个循环后，72℃延伸10min；
A14E1-402aa基因的回收；
A2pMD-E1-402aa质粒的构建；
A21感受态细胞的制备；
A22连接和转化；
取pMD19-T载体和回收的E1-402aa的cDNA，于16℃连接过夜；
A23pMD-E1-402aa重组质粒的鉴定；
A3pCI-E1-402aa真核表达质粒的构建；
A31E1-402aa基因片段的酶切回收；
用EcoRI和SalI对pMD-E1-402aa进行双酶切；
A32pCI-neo载体的酶切回收；
用EcoRI和SalI对pCI-neo进行双酶切；
A33连接与转化；
取酶切回收的pCI-neo片段和酶切回收的E1-402aa目的基因，于16℃连接过夜；
A34重组质粒的鉴定；
将转化好的菌扩大培养后，小量提取质粒，用EcoRI和SalI对质粒进行双酶切，用1％的琼脂糖凝胶电泳；酶切鉴定阳性的重组质粒进行测序，将测序正确质粒命名为pCI-E1-402aa。
2.应用权利要求1所述JEV优势抗原表位E1-402aa重组质粒制备的JEV优势抗原表位E1-402aa核酸疫苗。
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