[发明专利]JEV优势抗原表位E1-402aa重组质粒的制备方法及疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种JEV优势抗原表位E_1-402aa重组质粒的制备方法及疫苗，用于乙型脑炎的防治。

背景技术

乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒，是流行性乙型脑炎的病原体，属于黄病毒科。乙脑是严重威胁人畜健康的一种急性传染病，患者病死率高，并可造成严重的神经系统后遗症。JEV病毒的流行有严格的季节性，主要在夏秋季流行，属于自然疫源性疾病，病毒通常在蚊→猪→蚊等多种动物间循环，是一种寄生宿主很广的病毒，在八十年代就有大熊猫患乙型脑炎的研究。我国除西部少数省、自治区外，大部分地区都有JEV的流行。

乙型脑炎病毒核酸为单股正链RNA，含11000个碱基，只有一个开放阅读框，能通过转录、翻译、切割成多种结构蛋白和非结构蛋白，其3种结构蛋白为囊膜蛋白E、膜蛋白M和衣壳蛋白C，7种非结构蛋白为NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。而能在保护性免疫及防治病毒感染起着重要作用的是E结构蛋白。白细胞介素7是一种机体调节免疫功能的细胞因子，能通过多种环节促进T细胞的增殖、活化，并能刺激MHC II类抗原等多种细胞表面分子的表达和多种细胞因子的产生，且已被广泛应用于DNA疫苗佐剂的研究中。

近年来，因为核酸疫苗能诱导机体产生广泛的免疫反应，使得核酸疫苗受到了很多学者的关注。并且核酸疫苗更便宜，更安全，更易于工业生产。而乙型脑炎疫苗也有了大量的关于核酸疫苗的研究。

McCown等将乙脑的E和NS1重组杆状病毒，用重组后的病毒接种细胞，然后免疫小鼠。结果表明，可以合成E蛋白和NS1蛋白的免疫组能有70％保护力，而只可以表达NS1蛋白的免疫组却不能产生保护力。

Konishi等用含prM和E蛋白的重组质粒pcDNA-JE-ME免疫小鼠，二免后用致死量的乙脑攻毒，小鼠存活率100％，且保护能力能保持半年。

Lorenz等构建了一个携带JEV M蛋白C末端的15氨基酸的E基因重组质粒，这15个氨基酸残基能作为E蛋白的信号肽，用重组的质粒免疫小鼠。结果表明，该疫苗能刺激小鼠产生较高的JEV特异性中和抗体，并能抵抗致死量的乙脑病毒攻毒，但滴度略低于乙脑弱毒苗。说明在prM的帮助下，E蛋白能正确折叠和组装。而Chen等去掉了prM基因，结果疫苗诱导的中和抗体滴度相对较低。

Chang等人将编码JEV prM和E蛋白基因重组质粒免疫小鼠，结果表明，能疫苗能刺激动物产生中和抗体，并能抵制致死量乙脑病毒的攻击。

Lin等将含有JEV囊膜蛋白基因prM和非结构蛋白基因NS1的质粒DNA肌肉注射到小鼠体内。结果表明，免疫prM质粒的小鼠，有70％的保护率；而免疫NS1质粒的小鼠保护率为90％，空载体pcDNA3.1也有40％的保护率，说明了空载体有非特异性免疫佐剂作用。NS1质粒不能刺激产生中和抗体，但能刺激疫苗免疫和补体反应。但是，当NS1和NS2A蛋白N端的60个氨基酸同时免疫小鼠后却不能提供有效的保护。推测NS1蛋白加上NS2A蛋白N端的60个氨基酸后使细胞表面的NS1蛋白的含量降低了。

吴玉水等构建了三种乙型脑炎的新型疫苗，DNA疫苗、E蛋白病毒样颗粒疫苗和DNA疫苗。分别免疫小鼠后。结果表明，这三种新型疫苗都能诱发小鼠产生相应的JEV特异性中和抗体。

Kaur等构建了乙型脑炎prM和E基因的重组质粒，分别以基因枪和肌肉注射的方式免疫小鼠，剂量分别为1μg／只和100μg／只。结果表明，肌肉注射方式的质粒诱导抗E蛋白的抗体滴度显著高于基因枪免疫组。但两种质粒都可以诱导动物产生特异性JEV中和抗体。质粒免疫的方法不同，效果也有差异。可能因为肌肉注射与基因枪相比，肌肉注射的重组质粒明显高于基因枪的质粒的含量。

非结构蛋白也是很重要的研究内容，Lin等构建了乙脑NS1蛋白的重组质粒，免疫小鼠后，能产生一定的保护力。Chen等构建了含有NS2A蛋白N端60个氨基酸的NS1的核酸疫苗，免疫后的小鼠不能抵御致死量病毒的攻毒。分析得出，单独表达的NS1蛋白能产生二聚体分泌到细胞外，但加上了60个氨基酸的NS1不能使NS1蛋白分泌到细胞外。

现在对核酸疫苗的研究主要从目的基因的选择和质粒载体的优化，加入免疫佐剂等方面来完善核酸疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种JEV优势抗原表位E_1-402aa重组质粒的制备方法及疫苗。

本发明的技术方案如下：