[发明专利]利用转基因技术提高油菜对鳞翅目害虫抗性的方法

摘要

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种利用转基因技术提高油菜对鳞翅目害虫抗性的方法。本发明的特征是：将人工合成的Bt杀虫基因cry1C*通过农杆菌介导的方法转化油菜，进一步通过PCR及Southern杂交检测外源基因是否整合到油菜基因组，利用实时定量RT-PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测cry1C*基因在转录和蛋白水平上的表达情况。抗虫性鉴定的结果显示，转基因油菜对鳞翅目害虫的抗性显著增强。本发明操作简便，不仅能够显著提高油菜对鳞翅目害虫的抗性，同时对植物的正常生长无影响，适用于油菜的抗虫育种。

主权项

利用转基因技术提高油菜对鳞翅目害虫抗性的方法，其特征在于下列步骤：（1）利用cry1C*基因的双元表达载体，通过农杆菌介导的方法转化油菜，以油菜无菌苗下胚轴为外植体，将侵染农杆菌并进行共培养后的下胚轴切段转移到含有筛选剂的愈伤组织诱导培养基和芽再生培养基上，将具有抗性的再生苗转移到生根培养基中，将生根后的幼苗转移到温室进行培养；（2）对转化植株进行PCR和Southern杂交检测，确定转基因阳性株，PCR检测和Southern杂交探针扩增，使用的特异引物如下：正向引物：cry1C‑F 5′‑TCGACATCTTGAACAACCTT‑3′；反向引物：cry1C‑R 5′‑CTACTTTTGTGCTCTTTCAA‑3′；（3）通过实时定量RT‑PCR对转基因阳性株中cry1C*基因的转录水平进行检测，cry1C*的扩增引物如下：正向引物：cry1C‑193F 5′‑GGAATCGTTGGACCTTCTCA‑3′；反向引物：cry1C‑391R 5′‑CGATCACTCTGGTCCTGGTT‑3′；内参基因BnActin的扩增引物如下：正向引物：actin‑F 5′‑ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC‑3′；反向引物：actin‑R 5′‑TGCCTCATCATACTCAGCCTTG‑3′；（4）利用ELISA方法对转基因阳性株进行检测，确定植株中Cry1C*的蛋白含量；（5）进一步对转基因株系进行鳞翅目害虫的抗虫性鉴定，明确转基因株系的抗性水平，获得抗虫转基因油菜株系；其中：步骤（1）中所述的cry1C*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；步骤（1）中所述的筛选剂，根据使用的双元载体的选择标记选择对应的筛选剂，其中的筛选剂为草铵膦；步骤（2）中所述的PCR扩增片段和Southern杂交探针序列如SEQ ID NO：3所示；步骤（4）中所述的Cry1C*蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；上述步骤中的培养基成分如下：无菌苗培养基M0：1/2MS，7g/L琼脂粉（Agargel），pH=5.8；液体培养基DM：MS，30g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，pH=5.8；共培养培养基M1：MS,30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L 2,4‑二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，100μm乙酰丁香酮，2.5g/L植物凝胶（Phytagel），pH=5.8；愈伤组织诱导培养基M2：MS，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L 2,4‑二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，20mg/L硝酸银，270mg/L替门汀，5mg/L草铵膦，2.5g/L植物凝胶,pH=5.8；芽再生培养基M3：MS，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L 2‑(N‑吗啉)乙烷磺酸，0.1mg/L吲哚乙酸，2mg/L反式玉米素，270mg/L替门汀，5mg/L草铵膦，2.5g/L植物凝胶，pH=5.8；生根培养基M4：1/2MS，10g/L蔗糖，0.5mg/L吲哚丁酸,150mg/L替门汀,8g/L琼脂粉,pH=5.8。