[发明专利]一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法有效
申请号: | 201310131488.7 | 申请日: | 2013-04-16 |
公开(公告)号: | CN104109204B | 公开(公告)日: | 2017-11-07 |
发明(设计)人: | 杨代常;施婧妮;欧吉权 | 申请(专利权)人: | 武汉禾元生物科技股份有限公司 |
主分类号: | C07K14/79 | 分类号: | C07K14/79;C07K1/18 |
代理公司: | 北京律诚同业知识产权代理有限公司11006 | 代理人: | 黄韧敏 |
地址: | 430079 湖北省*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | 本发明提供了一种从转基因水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的层析方法,包括以下步骤(1)以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料,采用提取缓冲液制备rLF粗提液;(2)用阳离子交换层析分离纯化rLF粗提液,获得纯化的rLF目标物。所述层析方法还进一步包括填料再生的步骤。 | ||
搜索关键词: | 一种 水稻 种子 分离 纯化 重组 铁蛋白 方法 | ||
【主权项】:
一种从转基因水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的层析方法,依次包括以下步骤:1)从转基因水稻种子中提取重组人乳铁蛋白,获得含重组人乳铁蛋白的粗提液;其中,所述提取包括下述步骤:(a)以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料,将稻谷脱壳成半精米并研磨成80‑100目的米粉;(b)将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5‑1:10的比例混合,常温下提取0.5‑2小时,获得混合物;所述提取缓冲液为:10‑25mMTris、10‑25mMNaAC,0‑250mMNaCl,pH6.0‑7.5;(c)将混合物过滤,得到含重组人乳铁蛋白的粗提液;2)将由步骤(1)获得的含重组人乳铁蛋白的粗提液经过阳离子交换层析,进行初级分离纯化,获得含重组人乳铁蛋白的洗脱液;其中:所述阳离子交换层析介质为CMsepharose FF弱阳离子交换填料,层析步骤为:2A)采用5‑15倍柱体积的pH为6.0‑7.5的10‑25mMTris、10‑25mMNaAC,0‑250mMNaCl缓冲液,以50‑200cm/小时的流速平衡层析柱;2B)以步骤1)的粗提取液作为上样样品,其中样品电导为2‑25ms/cm,pH为6.0‑7.5;用洗杂缓冲液洗脱杂质,洗杂缓冲液含3‑10mMNaH2PO4,3‑10mMNa2HPO4,200‑300mMNaCl,pH6.5‑8.0,洗脱流速为50‑200cm/小时;2C)用3‑10mMNaH2PO4,3‑10mMNa2HPO4,400‑650mMNaCl,pH6.5‑8.0洗脱缓冲液以50‑200cm/小时的流速洗脱样品,得洗脱液;3)收集步骤2)所述洗脱液,获得含重组人乳铁蛋白的溶液;由所述方法获得的重组人乳铁蛋白的HPLC纯度高于95%;4)在步骤3)之后将使用后的层析柱填料通过下述步骤再生:4a)以3‑10倍柱体积1‑2MNaCl,pH6.5‑10.0的高盐溶液以50‑200cm/小时的流速冲洗柱子至UV280无明显变化;4b)以3‑10倍柱体积5‑25mM柠檬酸钠,pH2.0‑4.0的缓冲溶液以50‑200cm/小时的流速冲洗柱子;4c)以2‑5倍柱体积的0.5‑1.0MNaOH溶液以30‑100cm/小时的流速反冲层 析柱;4d)以8‑15倍柱体积的超纯水冲洗柱子至pH小于10.0,将填料保存在20%的乙醇溶液中。
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- 本发明公开了纽虫重组铁结合蛋白及制备方法,该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示;该纽虫重组铁结合蛋白是从纽虫体壁中,通过RNA提取,cDNA合成,对cDNA的载体扩大培育得到阳性克隆质粒,阳性克隆质粒扩增、酶切后,与载体连接培育得到重组质粒,重组质粒培育后破碎及蛋白纯化得到纽虫重组铁结合蛋白;该方法得到的纽虫重组铁结合蛋白产量远远高于目前从动物肾脏提取的铁结合蛋白,用Ni-NTA得到的铁结合蛋白纯度较高,铁结合蛋白结合铁能力较好,还具有富集重金属和有机磷的作用。
- 尘螨过敏原Derf29和Derf30及其基因和应用-201310034209.5
- 赖仞;安输;容明强;李东升 - 中国科学院昆明动物研究所
- 2013-01-29 - 2013-05-01 - C07K14/79
- 本发明涉及一种尘螨过敏原Der f 29和Der f 30及其基因和应用,属于生物医学技术领域。尘螨过敏原Der f 29和Der f 30、分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。编码尘螨过敏原Der f 29和Der f 30的基因,分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成。所述的尘螨过敏原Der f 29和Der f 30在制备治疗尘螨过敏性疾病药物中的应用。本发明的有益效果在于:提供尘螨过敏Der f 29和Der f 30及其基因,尘螨过敏原Der f 29和Der f 30能够作为制备治疗尘螨过敏性疾病药物的应用。
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