[发明专利]高效表达人PKM1蛋白的DLD1稳定细胞株及其构建方法

摘要

本发明公开了一种高效表达人PKM1蛋白的DLD1稳定细胞株及其构建方法，属于动物细胞株领域。该细胞株的建立方法是构建重组人PKM1基因慢病毒表达载体，慢病毒包装、收获，转染DLD1细胞，经puromycin筛选、RT-PCR和Western blot技术检测，得到稳定细胞株。依照该方法建立的稳定细胞株为研究结肠癌Wnt信号通路与肿瘤能量代谢提供了有力的工具。

主权项

一种高效表达人PKM1蛋白的DLD1稳定细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1）利用基因重组技术将人PKM1基因克隆入慢病毒表达载体pLVX‑AcGFP1‑N1中，构建成pLVX‑AcGFP1‑N1‑PKM1，重组质粒经酶切鉴定；2）在10cm的培养皿中铺1.4×106个293T细胞，加入10mL含10%胎牛血清、无抗生素的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养细胞使汇合度达到80%；3）在无菌EP管中将载体pLVX‑AcGFP1‑N1‑PKM1、psPAX2、pMD2.G以质量比为4：3：1且总体积不超过120ul混合，按磷酸钙法转染293T细胞；48h后收集293T细胞的上清，在100kD浓缩管中2000r/min离心10min，除去细胞碎片，得到病毒浓缩液，于－80℃长期保存；4）在6孔板中培养DLD1细胞，用含10%胎牛血清不含任何抗生素的RPMI‑1640培养基，37℃、5%CO2的培养箱中培养，使细胞汇合度达到80%；然后换含8μg/ml polybrene的RPMI‑1640培养基，加入100ul步骤3）得到的病毒浓缩液，转染48h后，加入终浓度5μg/mL的puromycin进行加药筛选；每3天更换一次含5μg/mL puromycin的RPMI‑1640培养基，筛选4周后在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性细胞簇在96孔板中筛选；5）通过RT‑PCR鉴定阳性细胞簇、扩大培养，收获蛋白再用Western blot进行鉴定，最终获得稳定细胞株，将其冻于液氮中保藏。