[发明专利]焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法

摘要

本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法，先依据隐孢子虫18S rRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以18SrRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发明适用于对隐孢子虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证，操作极为简便，所需样品量小。

主权项

一种焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法，其特征在于，首先依据隐孢子虫18S rRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以18S rRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫；所述的设计隐孢子虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的18S rRNA基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计焦磷酸测序引物以确证是否为隐孢子虫；隐孢子虫PCR及测序引物为：18S rRNA基因上游引物5’‑CTTGAATACTCCAGCATGGAATAA‑3’，5’进行生物素标记18S rRNA基因下游引物5’‑TCCCCTAACTTTCGTTCTTGATT‑3’，18S rRNA基因测序引物5’‑ATACAAATGCCCCCA‑3’；隐孢子虫18S rRNA基因的目标序列：ACTGTCCCTA TTAATCATTA TTCTT；扩增片段长度为201bp。