[发明专利]高通量测序文库的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了提供了高通量测序文库的构建方法及其应用。其中，构建高通量测序文库的方法包括：将基因组DNA片段化；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；利用特异性探针对连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；将该目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将该目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成高通量测序文库。采用本发明的构建高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库。

主权项

一种构建高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段；将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得连接产物；利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；将所述目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成所述高通量测序文库，其中，所述特异性探针是对已知甲基化位点特异性的，所述特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用已知具有甲基化位点的基因区域作为靶序列而设计的，所述已知具有甲基化位点的基因区域为表I中所列出基因的至少一种的编码区和启动子区，任选地，在进行杂交捕获之后，在进行PCR扩增之前，将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，任选地，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种，优选所述基因组DNA为人类全血基因组DNA，更优选所述基因组DNA为外周血单核细胞基因组DNA，优选，所述基因组DNA的量为2μg，任选地，利用covaris‑S2打断仪将基因组DNA片段化，任选地，所述DNA片段的长度为约150‑300bp，优选200‑300bp，任选地，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤，任选地，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性，任选地，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow(3’‑5’exo‑)进行的，任选地，所述甲基化接头中包含标签，任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，进一步包括对接头进行甲基化的步骤，任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4DNA连接酶进行的，任选地，在获得连接产物后，进一步包括对连接产物进行纯化的步骤，任选地，所述已知具有甲基化位点的基因区域包括选自启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的至少一种，任选地，所述编码区为外显子区域序列，所述启动子区为基因转录起始位点的上游2200bp到下游500bp的区域，任选地，所述特异性探针是采用eArray系统设计的，任选地，所述探针的长度为12mer，任选地，在所述杂交捕获前，进一步包括利用c_ot‑1DNA和接头封闭序列分别对所述连接产物和所述连接产物上的甲基化接头进行杂交封闭的步骤，优选采用过量的c_ot‑1DNA对所述连接产物进行杂交封闭，可选地，所述接头封闭序列包括选自Block1和Block2的至少一种，任选地，采用1μg的连接产物进行所述杂交捕获，任选地，利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获进一步包括利用链霉素磁珠捕获所述目的片段，任选地，在将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，进一步包括将所述目的片段与片段化的λ‑DNA混合，优选所述片段化的λ‑DNA的量为200‑400ng，更优选200ng，任选地，将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理是采用EZ DNA Methylation‑Gold Kit^TM（ZYMO）进行的，任选地，使用热启动taq DNA聚合酶进行所述PCR扩增，任选地，分离纯化所述扩增产物是通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2%的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行的，优选通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行，任选地，所述高通量测序文库的文库片段长度为300‑450bp。